استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر Sterivex فلاتر والسيزيوم كلوريد التدرج الكثافة الطرد المركزي
Summary
نحن تصف طريقة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي الجينومية من الكتلة الحيوية العوالق ركزت على 0.22 ميكرون Sterivex المرشحات ، تليها السيزيوم كلوريد كثافة الطرد المركزي لتنقية الانحدار.
Abstract
وتستخدم هذه الطريقة لاستخراج عالية الجينومية الوزن الجزيئي من الحمض النووي من الكتلة الحيوية العوالق ركزت على 0.22 ميكرومتر Sterivex الفلاتر التي تم التعامل مع تخزين / تحلل العازلة والمؤرشفة في -80 درجة مئوية ، وتطهير هذا الحمض النووي باستخدام كثافة كلوريد السيزيوم التدرج. بروتوكول تبدأ مع اثنين من الخطوات الحضانة لمدة ساعة لتحرير الحمض النووي من الخلايا وإزالة الحمض النووي الريبي. المقبل ، سلسلة من الفينول : يتم تنفيذ عمليات الاستخراج وأعقب الكلوروفورم الكلوروفورم بواسطة الطرد المركزي لإزالة البروتينات ومكونات غشاء الخلية ، وجمع من استخراج الحمض النووي مائي ، وعدة خطوات تبادل العازلة لغسل وتركيز استخراجها. الجزء الخامس يصف تنقية كلوريد السيزيوم اختياري عبر التدرج الكثافة. فمن المستحسن للعمل مع أقل من 15 عينة في وقت واحد لتجنب الارتباك وخفض الوقت البروتوكول. إجمالي الوقت اللازم لهذا البروتوكول يعتمد على عدد من العينات ليكون استخراجه. عينات لمدة 10-15 وعلى افتراض معدات الطرد المركزي الصحيح هو متاح ، وينبغي أن تأخذ هذا البروتوكول بأكمله 3 أيام. تأكد من أن يكون لديك مجموعة أفران التهجين إلى درجة الحرارة في بداية العملية.
Protocol
Discussion
اعتمادا على عدد العينات التي سيتم تجهيزها ، وهذا يمكن أن يكون الإجراء الوقت كثيفة بسبب خطوتين الحضانة لمدة ساعة ، ويغسل وتتكرر الخطوات الطرد المركزي. فمن الأفضل أن خطة يومين كله لهذا الإجراء لترك متسع من الوقت. إذا كانت هناك مشاكل في الحصول على حجم استخراج النهائي في …
Acknowledgements
نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. كان مدعوما من قبل JJW زمالات من NSERC وشعبة النهوض بالمرأة كان مدعوما من الزمالات NSERC ، Killam ومؤسسة التمويل مركز تولا للتنوع وتطور الميكروبية. كان مدعوما من قبل المركز SL تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
