Экстракции ДНК из 0,22 мкм Фильтры Sterivex и цезия хлорид центрифугирования в градиенте плотности
Summary
Мы опишем метод для извлечения высокой молекулярной геномной ДНК весом от биомассы планктона сосредоточена на 0,22 мкм фильтры Sterivex, затем хлорид цезия центрифугирования в градиенте плотности для очищения.
Abstract
Этот метод используется для получения высокой молекулярной геномной ДНК весом от биомассы планктона сосредоточена на 0,22 мкм фильтры Sterivex, которые были обработаны с хранением / лизис буфера и архивируются при -80 ° С, и, чтобы очистить эту ДНК с использованием градиента плотности цезия хлорид. Протокол начинается с двух часовую инкубацию шаги, чтобы освободить ДНК из клеток и удаления РНК. Далее, серия фенол: хлороформ и хлороформ извлечения выполняются с последующим центрифугированием для удаления белков и компонентов клеточной мембраны, сбор водного экстракта ДНК, и несколько буфер обмена шаги, чтобы вымыть и концентрат экстракта. Часть пятая описывает дополнительные очистки с помощью градиента плотности цезия хлорид. Рекомендуется работать с менее чем 15 образцов за один раз, чтобы избежать путаницы и сократить протокол времени. Общее время, необходимое для этого протокола зависит от количества образцов должны быть извлечены. За 10-15 образцов и при условии надлежащего оборудования центрифугирования доступен весь этот протокол должен занять 3 дня. Убедитесь, что у вас есть набор гибридизации печи до температуры, при начале процесса.
Protocol
Discussion
В зависимости от количества образцов, подлежащих обработке, это может быть временных затрат процедура из-за двух часовых этапов инкубации, а также неоднократные моет и центрифугирования шагов. Лучше всего планировать целых два дня эту процедуру, чтобы оставить достаточно времени. Есл?…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и Национального наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC) Канады за поддержку проводимых исследований на регионах с низким уровнем кислорода в прибрежных и открытых водах океана. JJW была поддержана стипендии NSERC и ОУПЖ была поддержана стипендии NSERC, Киллам и ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции. SL была поддержана ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
