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Summary
Descriviamo un metodo per l'estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.
Abstract
Questo metodo è utilizzato per estrarre DNA genomico ad alto peso molecolare peso da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 mM Sterivex che sono stati trattati con memorizzazione / buffer di lisi e archiviati a -80 ° C, e per purificare il DNA utilizzando un gradiente di densità di cloruro di cesio. Il protocollo inizia con due di un'ora le fasi di incubazione per liberare il DNA dalle cellule e rimuovere l'RNA. Poi, una serie di fenolo: cloroformio e estrazioni Cloroformio vengono eseguite seguita da centrifugazione per rimuovere le proteine e componenti della membrana cellulare, la raccolta del DNA estratto acquoso, e diverse fasi di scambio tampone per lavare e concentrare l'estratto. Parte quinta descrive la purificazione opzionale tramite gradiente di densità di cloruro di cesio. Si consiglia di lavorare con meno di 15 campioni in una sola volta per evitare confusione e ridurre i tempi del protocollo. Il tempo totale richiesto per questo protocollo dipende dal numero di campioni da estrarre. Per 10-15 i campioni e assumendo l'attrezzatura corretta centrifugazione è disponibile, questo protocollo intera dovrebbe prendere 3 giorni. Assicurarsi di avere i forni ibridazione impostata la temperatura all'inizio del processo.
Protocol
Nota: Tutti i reagenti usati in questo protocollo sono aliquotati dalle scorte di laboratorio in piccoli stock di lavoro-questo è molto importante per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA e la contaminazione delle scorte di laboratorio. Inoltre, quando pipettaggio, assicurarsi di modificare puntali per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate.
Parte prima: la lisi cellulare e digestione
- Iniziare questo protocollo da scongelamento i filtri Sterivex che contengono biomassa planctonica precedentemente concentrato sul ghiaccio. Per semplicità, qui descritta la procedura per l'elaborazione di un singolo filtro. In pratica, si consiglia di elaborazione 16 o meno dei filtri alla volta.
- Una volta che il filtro ha scongelato, iniziare il primo dei due incubazioni: uno per lisare le cellule e rimuovere l'RNA, e quello di rompere le proteine. Per la prima incubazione, aggiungere 100 microlitri lisozima (125 mg in 1000 ml TE) e 20 ml di RNasi A (10 mcg / ml) per il filtro. Richiudere il filtro con Parafilm e lasciare a ruotare nel forno di ibridazione a 37 ° C per 1 ora.
- Per l'incubazione prossimo, aggiungere 100 microlitri proteinasi K e 100 ul SDS 20% al filtro. Richiudere con Parafilm e lasciare a ruotare 1-2 ore in più nel forno di ibridazione, questa volta a 55 ° C.
- Utilizzando una siringa 5cc, trasferire il lisato dal filtro Sterivex in una provetta da 15 ml Falcon. Sciacquare il filtro con 1 ml di tampone di lisi e aggiungere il liquido di risciacquo al lisato nel tubo Falcon con la siringa 5cc. Ora che avete lisati e digerito le vostre cellule, si è pronti per estrarre il proprio DNA.
Parte seconda: Estrazione del DNA
- Il passo successivo è quello di utilizzare il metodo fenolo-cloroformio per estrarre il DNA dal lisato. Aggiungere un volume equivalente (circa 3 ml) di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (IAA) per il tubo di lisato, avendo cura di cambiare puntali per pipette per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Vortex per 10 secondi per mescolare bene.
- Rotazione del tubo a 2500 g per 5 minuti, assicurandosi che la centrifuga è equilibrata. Durante la centrifugazione, il fenolo-cloroformio-lisato miscela deve separare in due strati: uno strato organico contenente il fenolo, cloroformio, e le proteine dal campione, sul fondo, e uno strato acquoso, che consiste del vostro DNA, acqua e altri molecole più idrofile, in cima.
- Trasferire la fase acquosa (contenente il DNA) in un nuovo tubo 15 ml Falcon. Fare attenzione a non toccare l'interfaccia con la punta della pipetta (sempre lasciare una piccola quantità dello strato acquoso dietro).
- Per questo nuovo tubo, aggiungere un volume equivalente (circa 3 ml) di Cloroformio: IAA, avendo cura di cambiare puntali per pipette per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Vortex per 10 secondi. Questo passaggio consente di rimuovere qualsiasi residuo fenolo dal campione di DNA.
- Rotazione a 2500 g per 5 minuti o fino a strato acquoso è chiara. Trasferimento strato acquoso in una nuova provetta Falcon e aggiungere 1 ml di TE a pH 8.0, facendo attenzione a non toccare l'interfaccia con la punta della pipetta (sempre lasciare una piccola quantità dello strato acquoso dietro). Questo strato acquoso contenente il DNA estratto.
Parte terza: La concentrazione del DNA e di lavaggio
- Il passo successivo è quello di lavare e concentrare il campione di DNA in un tubo da 15 ml per centrifuga Amicon Ultra. I tubi Amicon costituiti da un filtro che trattiene le molecole pari o superiore a un determinato peso molecolare (il retentato) e un tubo per prendere il flow-through (il filtrato). In questo caso, il filtro trattiene il vostro DNA (il retentato). Trasferite i vostri estrarre il DNA da 2,5 a passo il vano del filtro di un tubo Amicon Ultra.
- Rotazione a 3500 g per 10 minuti. Controllare per assicurarsi che non vi è meno di 1 ml di liquido trattenuta dal filtro Amicon. Se rimane più retentato, riempire il filtro con TE e girare di nuovo. Assicurarsi di utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta TE per evitare contaminazioni incrociate.
- Rimuovere il flusso continuo, o filtrato, ad un altro tubo Falcon e salvarlo in frigo prima di aver confermato il vostro prodotto finale di DNA su un gel (parte quarta).
- Aggiungere 2 ml di tampone TE al filtro Amicon e far girare a 3500 g per 6 minuti, avendo cura di usare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta TE per evitare contaminazioni incrociate. Filtrato con piscina che dal punto 3.3 e salvare in frigorifero.
- Lavare il DNA altre due volte con TE, per un totale di tre lavaggi (avendo cura di usare sempre un nuovo puntale per pipetta), e salvando il filtrato di volta in volta (come passi al 3.3 e 3.4). Per l'ultimo lavaggio, rotazione fino a 200 a 500 ml di resti retentato nel filtro Amicon. Registrare il volume finale e trasferire i retentato (contenente il DNA) in una provetta etichettata 1,5 ml Eppendorf.
Parte quarta: Determinazione della qualità del DNA
- Controllare la qualità del DNA e valutare la concentrazione del DNA da parte esaurendo i campioni su un gel di agarosio 0,8% gel staINED con 1 ml di etidio bromuro (EtBr) durante la notte. (Siate molto prudenti quando si usa EtBr-it è un noto agente mutageno e cancerogeno. Assicurati di cambiare spesso i guanti ed evitare di EtBr trasferimento al resto del laboratorio e per la pelle.) Caricare i campioni accanto alla scale del DNA, che servono come standard di dimensioni e intensità (vedi punto successivo).
- Nelle corsie prima diversi, scale carico con bande di vari pesi molecolari e concentrazioni. Si consiglia il seguente schema di carico: nelle corsie primo e l'ultimo (corsia esterna), carico 10 ml di 50ng/μl di 1kb + o scaletta 2log. Nelle corsie 2,3 e 4, carico 2 microlitri, 5 microlitri, e 10 microlitri, rispettivamente, della scala 50ng/μl λHindIII. Infine, carico 5 microlitri per corsia di estrarre il DNA con la tintura per ogni campione.
- Attivare il gel a 15 volt per circa 16 ore (si raccomanda di eseguire durante la notte).
- Il giorno dopo, fotografare il gel UV utilizzando un sistema di documentazione del gel. Per determinare il campo peso molecolare del DNA e la sua concentrazione, confrontare le bande campione per fasce di scale. DNA di buona qualità hanno un alto peso molecolare (> 36kb), e mostrano pochi segni di taglio / degrado. Vedere la Figura 1.
Parte quinta: centrifugazione su gradiente di cloruro di Cesio
- Se la qualità del DNA è buona e in quantità sufficiente, si può procedere per purificare il DNA eseguendo un cloruro di cesio (CsCl) centrifugazione in gradiente. Si noti che questa fase di purificazione è opzionale e non è necessario per tutte le applicazioni a valle (per esempio, se si desidera generare librerie fosmid DOVRESTE purificare, mentre se si vuole semplicemente effettuare reazioni di PCR, purificazione di solito non è necessario). In primo luogo, etichetta un tubo per centrifuga per ogni campione.
- Per ogni provetta, aggiungere 160 mg di CsCl, 178 ml di DNA genomico. Dopo aver aggiunto CsCl e del DNA per il tubo, mettere un piccolo pezzo di parafilm sulla parte superiore del tubo e capovolgere delicatamente il tubo di 10-20 volte per miscelare i componenti. Non mescolare pipettando, che può causare taglio del DNA. Successivamente, aggiungere 10 ml di 10 mcg / EtBr microlitri di questo tubo e mescolare nello stesso modo. (Siate molto prudenti quando si usa EtBr-it è un noto agente mutageno e cancerogeno. Assicurati di cambiare spesso i guanti ed evitare di EtBr trasferimento al resto del laboratorio e alla vostra pelle.)
- Assicurarsi che il peso di tutti i tubi sono bilanciate prima della centrifugazione in modo che le differenze di peso tra i tubi sono inferiori a 1 mg.
- Collocare le provette nel rotore hemostat utilizzando, chiudere il coperchio e posizionare il rotore all'interno del ultracentrifuga.
- Chiudere la porta ultracentrifuga. Vuoto sarà applicato non appena si chiude la porta. Eseguire durante la notte a 100.000 giri al minuto per 18 ore e 20 ° C.
- Quando la centrifugazione è completo, estrarre i tubi dal rotore utilizzando hemostat e posto su un rack tubo.
- Visualizza il DNA con luce blu transilluminatore, o se non disponibile, un uso prolungato della luce UV di lunghezza d'onda, in una stanza buia. Indossare un paio di occhiali ambra filtro per vedere la band DNA. Vedere la Figura 2.
- Utilizzando una siringa sterile e 1cc ago (26G 5 / 8), rimuovere banda del DNA e collocarlo in un tubo Eppendorf 1,5 ml.
- Per aiutare a recuperare la maggior parte del DNA intrappolato nello spazio morto nella siringa, lavare la siringa con 100 ul TE e aggiungere la soluzione di risciacquo al tubo. Preparare un tubo con 100 microlitri di buffer TE per campione al fine di prevenire la contaminazione crociata.
- Per rimuovere EtBr dal DNA, aggiungere un volume equivalente di butanolo saturo d'acqua al tubo, invertire i tubi delicatamente 1-20 volte, centrifugare a 10000 rpm per 1 minuto e scartare lo strato superiore.
- Ripetere il lavaggio finché il colore di butanolo è trasparente, 3 - 4 volte di più.
- Posto 4 ml TE in una provetta da centrifuga Ultra Amicon e aggiungere la soluzione di DNA da sopra.
- Centrifugare a 3500 g a temperatura ambiente, fino a quando il volume del DNA è ridotto a circa 100-500 microlitri (circa 6-7 minuti) ed eliminare la flow-through.
- Aggiungi 2ml TE Amicon filtro e centrifugare a 3500 g per 6 minuti, avendo cura di usare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Ripetere due volte.
- Concentrato ad un volume finale di 50-100 microlitri per centrifugazione aggiuntive necessarie e trasferire la soluzione di DNA sul filtro a un nuovo tubo di 1,5 ml Eppendorf.
- Aggiungere 40 microlitri TE al filtro Amicon e pipettare su e giù lungo entrambe le membrane filtranti per lavare ogni residuo di DNA. Aggiungere a questa soluzione per il tubo in 5.15.
- Posizionare un microcontrollore YM-30 unità di filtro in un tubo microcontrollore e prelavaggio il microcontrollore con l'aggiunta di 200 microlitri di acqua in autoclave e la centrifugazione a 10000 rpm per 7 minuti.
- Aggiungere la soluzione di DNA da 5,16 a microcontrollore lavata al fine di concentrare ulteriormente il DNA. Centrifugare a 5000-10000 g per 1 - 3 minuti. Controllare la quantità di liquidosulla centrifugazione filtro e ripetere fino a quando la quantità di liquido nel filtro si riduce a circa 50 microlitri.
- Posizionare l'unità filtro a testa in giù in un tubo nuovo microcontrollore e centrifugare a 1000 g per 3 minuti. La quantità ideale di soluzione concentrata è di 50-60 microlitri.
- Misurare e registrare la concentrazione del DNA su un NanoDrop e controllo di qualità del picco (dovrebbero essere 260 nm).
- Trasferire una piccola aliquota del DNA in una provetta eppendorf pulita per lavorare fotografici e congelare a meno 20. Trasferire il resto del DNA per un secondo pulita eppendorf e conservare a meno 80.
Rappresentante dei risultati:
Quando questo protocollo è eseguita correttamente, si dovrebbe vedere un immagine gel dopo il passaggio a 4,4 Determinazione della qualità del DNA simile alla Figura 1. Concentrazione di DNA estratti effettiva varia a seconda della fonte del campione. Dopo passo 5,7 nel gradiente di CsCl centrifugazione, DNA genomico illuminata da luce blu dovrebbe essere simile alla Figura 2.
Figura 1. 0,8% di agarosio immagine elettroforesi su gel ad alto peso molecolare del DNA raccolti da quattro profondità nel subartiche Oceano Pacifico (in duplice copia), colorati con il intercalando agente di bromuro di etidio (10 mg / ml). Gel è stato eseguito a 15V per ~ 16 ore in tampone 1X TBE gel in esecuzione. Bande del campione sono di buona qualità che mostrano scarse prove di taglio meccanico (mostra singole bande o macchie invece di bande multiple) anche se gli estratti 10m conservano alcuni RNA riporto (vedi striscio nel range 0,5-2,0 Kb).
Figura 2. Banda DNA genomico illuminati dalla luce blu dopo la centrifugazione gradiente di CsCl.
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Discussion
A seconda di quanti campioni devono essere trattati, questo può essere un tempo ad alta intensità procedura a causa delle due fasi di incubazione di un'ora, e il ripetuti lavaggi e le fasi di centrifugazione. E 'meglio pianificare due giorni interi per questa procedura di lasciare un sacco di tempo. Se ci sono problemi a far il volume finale dell'estratto nel tubo Amicon di ridurre fino a 200-500μl al momento della concentrazione del DNA e il lavaggio, prova a fare ulteriori lavaggi e centrifugazioni TE (ripeto parte terza) fino a quando il volume appropriato è rimasto. Inoltre, se l'estratto odore acuto di cloroformio, è meglio fare ulteriori lavaggi fino a quando l'odore diminuisce per assicurarsi che tutto il cloroformio è stato rimosso. Ancora una volta, tutti i reagenti usati in questo protocollo sono aliquotati dalle scorte di laboratorio in piccoli stock di lavoro-questo è molto importante per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA e la contaminazione delle scorte di laboratorio. Inoltre, quando pipettaggio, assicurarsi di modificare puntali per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. JJW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC e DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution. SL è stato sostenuto dal Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
Biologia Molecolare Numero 31 microbiologia acqua di mare estrazione del DNA cesio gradiente di densità di cloruro di centrifugazioneErratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
