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Summary
我们描述了一个超高分子量从浮游生物的生物量基因组集中Sterivex 0.22微米的过滤器，氯化铯密度梯度离心纯化的DNA提取方法。
Abstract
这种方法是使用0.22微米Sterivex已存储/裂解液治疗，并存档于-80 ° C过滤器浮游生物质集中超高分子量基因组DNA提取和净化使用氯化铯密度梯度，这种DNA。该协议开始有两个小时的孵化步骤，从细胞中解放出来的DNA和删除的RNA。接下来，进行一系列的酚：氯仿和氯仿抽提随后通过离心去除蛋白质和细胞膜的成分，收集水的DNA提取液，清洗和集中提取的几个缓冲交换步骤。第五部分介绍了通过氯化铯密度梯度可选净化。建议工作在同一时间少于15个样品，以避免混乱和削减协议的时间。本议定书所需的总时间取决于要提取的样品的数量。 10-15个样本，并假设适当的离心设备，整个协议应采取3天。确保你有杂交的过程开始时设置温度的烤炉。
Protocol
注：在本议定书中所使用的所有试剂是从实验室股票分装成较小的工作库存，这是非常重要的，以避免交叉污染你的DNA样本和实验室股市污染。 此外，移液时，一定要改变每此外，避免交叉污染移液器。
第一部分：细胞裂解和消化
- 开始融化的冰包含以前集中的浮游生物质Sterivex过滤器本议定书。为了简单起见，这里我们描述的程序，用于处理个人过滤器。在实践中，我们建议在同一时间处理16个或更少的过滤器。
- 一旦过滤器已解冻，首先开始的两个孵化：裂解细胞，除去RNA，并之一分解蛋白质。对于第一个孵化，添加100μL溶菌酶（1000μLTE 125毫克）和20毫升RNA酶A（10微克/毫升）的过滤器。重新密封封口膜过滤和离开旋转在37℃，1小时杂交炉。
- 对于未来的孵化，添加100μL蛋白酶K和100μL20％SDS的过滤器。重新封装用封口膜，让它在杂交炉旋转一到两个小时以上，这一次在55 ° C
- 使用5CC针筒，从Sterivex过滤器转移到一个15毫升猎鹰管的裂解。用1 ml裂解液冲洗过滤器，并添加在您的猎鹰管裂解液使用5CC注射器冲洗液体。现在，你有你的细胞溶解和消化，你就可以提取他们的DNA。
第二部分：DNA的提取
- 下一步是用酚 - 氯仿法提取DNA裂解。加入等体积的苯酚（约3毫升）：氯仿：异戊醇（IAA），裂解管，一定要改变每个此外枪头，避免交叉污染。涡为10秒拌匀。
- 在2500克5分钟的旋转管，确保离心机平衡。在离心，酚 - 氯仿裂解液混合应分成两层：您的样品含有苯酚，氯仿和蛋白质在底部的有机层，水层，包括你的DNA，水，和其他更多的亲水性分子，在最前面。
- 转移到一个新的15毫升猎鹰管的水层（含你的DNA）。要小心不要碰到枪头（总是留下少量背后的水层）的接口。
- 这一新的试管中，加等体积的氯仿（约3ML）：生长素，一定要改变每个此外枪头，避免交叉污染。涡为10秒。此步骤有助于从你的DNA样本中删除任何剩余的苯酚。
- 2500克分拆为5分钟，或直至水层是明确的。转移到一个新的标记猎鹰管水层，并在pH 8.0中添加1毫升的TE，小心不要碰到枪头（总是留下少量背后的水层）的接口。这个水层包含您的DNA提取。
第三部分：DNA浓度和洗涤
- 下一步是清洗和集中在15毫升Amicon超离心管的DNA样本。 Amicon管组成一个过滤器，保留或以上指定的分子量截留和管分子赶上流（滤液）。在这种情况下，过滤掉你的DNA（截留）。您的DNA提取步骤2.5传输Amicon超管过滤器舱。
- 10分钟旋转3500克。检查，以确保有少于1毫升液体保留在Amicon过滤器。如果再次更截留的遗体，笔芯用TE的过滤器和旋转。确保使用每TE另外一个新的枪头，避免交叉污染。
- 取出流过，或滤液，到另一个猎鹰管，在冰箱中保存，直到您确认您的最终DNA凝胶产品（第四部分）。
- 加入2 ml TE缓冲液中的Amicon过滤器和旋转3500克为6分钟，确保每个TE除了使用一个新的枪头，避免交叉污染。游泳池与步骤3.3滤液，保存在冰箱中。
- 洗净的三个清洗（一定要始终使用一个新的枪头）的总DNA用TE两倍以上，并保存每次滤液（如3.3和3.4％的步骤）。最后一次洗涤，旋转，直到200至500毫升Amicon过滤截留仍然。记录最终体积和转移截留（含你的DNA）一个标记的1.5 mL Eppendorf管。
第四部分：DNA质量的测定
- 检查的DNA质量和浓度的DNA凝胶0.8％琼脂糖凝胶STA运行您的样品估计独立非执行董事与1毫升溴化乙锭（ETBR）过夜。 （极为谨慎，在使用ETBR时，它是已知的诱变剂和可疑致癌物质。确保经常更换手套，并避免ETBR转移到了实验室的休息和你的皮肤。）装入样品的DNA梯子旁边，作为规模和强度标准（见下一步）。
- 在第几车道，装入不同的分子量和浓度的乐队的梯子。我们建议以下加载模式：在第一个和最后一个车道（最外面的车道），负载10μL50ng/μl的1KB +或2log阶梯。在2,3和4车道，负载2μL，5μL，10μL，分别50ng/μlλHindIII梯，。最后，负载5％的DNA与染料的提取，每个样品巷液。
- 运行约16小时15伏（我们建议运行过夜）凝胶。
- 第二天，照片使用紫外凝胶成像系统凝胶。要确定你的DNA，其浓度的分子量范围，比较样品带梯子的乐队。质量好的DNA分子量高（> 36KB），而且几乎没有证据显示剪切/退化。见图1。
第五部分：氯化铯梯度离心
- 如果DNA质量好，数量足够的，可以继续执行氯化铯（CSCL）梯度离心纯化的DNA。请注意，这一步纯化是可选的，并不需要所有下游应用（例如，如果你要生成fosmid库，你应该净化，而 如果你只是想进行PCR反应，净化通常没有必要）。首先，一个标签，每个样品的离心管中。
- 每个离心管中，添加160毫克，178μL的基因组DNA中海集运。 CSCL和DNA管后，将封口膜管上的一个小块，轻轻颠倒管10到20倍，以组合的组成部分。不要混用吹打，这可能会导致DNA的剪切。接下来，添加10μL10μg/μL的ETBR此管，并以同样的方式混合。 （使用时极为谨慎ETBR，它是一种已知的诱变剂的和可疑致癌物质，确保经常更换手套，并避免ETBR转移到了实验室的休息和你的皮肤。）
- 确保所有管的重量是平衡前离心管之间的重量差异小于1毫克。
- 放置在转子使用止血钳管，盖上盖子，放在超速离心机内转子。
- 关闭超速离心机门。真空，将尽快关门。运行过夜100000 RPM为18小时和20 ° C
- 离心完成后，取出从一个试管架使用止血钳和地点转子管。
- 可视化与蓝色光透射的DNA，如果不可用，使用长波长的紫外线灯，在黑暗的房间里。穿一双琥珀色的过滤器眼镜，看到的DNA带。参见图2。
- 使用1CC一个无菌注射器和针头（26G 5 / 8），删除DNA条带，并放置在1.5毫升Eppendorf管。
- 为了帮助恢复，大部分被困在注射器中的死亡空间的DNA，与100μLTE冲洗注射器和清洗解决方案添加到管。 100μLTE缓冲每个样品准备一管，以防止交叉污染。
- 要删除的DNA ETBR，加等体积的水饱和正丁醇管，反转管轻轻10到20倍，在1分钟的转速10000离心机和丢弃的顶层。
- 重复清洗，直至丁醇的颜色是透明的，3 - 4次以上。
- 在Amicon超离心管置于4毫升TE和添加从上面的DNA溶液。
- 离心机在室温下在3500克，直到DNA量减少约100-500μL（约6-7分钟），并丢弃流过。
- 加入2ml TE Amicon过滤器和离心机3500克为6分钟，一定要使用每次添加一个新的枪头，避免交叉污染。重复两次。
- 集中到一个最终体积50-100微升，必要时可额外离心和DNA溶液过滤器转移到一个新的1.5 mL Eppendorf管。
- 加入40μLTE Amicon过滤器和吸管两侧滤膜向上和向下洗出任何剩余的DNA。加入这个解决方案在5.15管。
- 加入200μL灭菌水，并在7分钟10000转离心，放入一个单片机管和预洗的单片机的一个单片机YM - 30过滤装置。
- DNA溶液中加入5.16预洗单片机为了进一步集中的DNA。在5000-10000克为1 - 3分钟离心。检查的液体量离心过滤器和重复，直到液体过滤器上的金额减少约50μL。
- 过滤装置，倒挂在一个新的单片机管离心3分钟，并在1000克。理想的浓缩液量为50-60μL。
- 测量和记录的DNA Nanodrop的浓度和峰值质量检查（应260nm）。
- 一个小等份的DNA转移到一个干净的Eppendorf管工作在零下20的股票和冻结。其余的DNA转移到第二个干净的Eppendorf和冻结在零下80。
代表性的成果：
当这个协议是正确的，你应该看到后测定DNA的质量与图1类似的步骤4.4凝胶图像。实际提取DNA的浓度会有所不同取决于示例的源。在CsCl梯度离心5.7步后，蓝色的光芒照亮的基因组DNA应该类似于图2。
图1。0.8％琼脂糖凝胶电泳图像的超高分子量从四个深度在亚北极太平洋（一式二份）与嵌入剂，溴化乙锭（10毫克/毫升）染色，收集DNA。凝胶1X TBE凝胶电泳缓冲液中，在15V〜16小时运行。样品带呈现出良好的机械剪切几乎没有证据显示反对多个频段的单波段或涂片质量虽然10米的提取物保留一些RNA进行（见涂抹在0.5至2.0 KB范围）。
图2。基因组DNA带蓝色光照射后，CsCl梯度离心。
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Discussion
根据要处理多少样本，这可能是一个时间密集型的过程，由于两个小时的孵化步骤，和反复洗涤，离心步骤。这是最好的计划，此过程整整两天，留下充裕的时间。如果有问题Amicon管最终提取量减少了200 -500μL，在DNA的浓度和洗涤，尝试做更多的TE清洗和离心（重复第三部分），直到合适的音量是吃剩的。此外，如果敏锐的氯仿提取物的气味，这是最好做额外的清洗，直到气味减轻，以确保所有被删除的氯仿。同样，从实验室股在本议定书中所使用的所有试剂分装成较小的工作股票，以避免交叉污染你的DNA样本和实验室股市污染，这是非常重要的。此外，移液时，一定要改变每此外，避免交叉污染移液器。
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Acknowledgments
我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会（NSERC），加拿大的加拿大基金会。 JJW是由NSERC和DAW奖学金的支持是由NSERC，Killam和图拉基金会资助的微生物多样性和进化中心奖学金的支持。 SL是由微生物多样性和进化图拉基金会资助中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
微生物学，分子生物学，第31期，海水，DNA提取，氯化铯密度梯度离心Erratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
