我们描述了一种从0.22 μm Sterivex滤膜上浓缩的浮游生物生物量中提取高分子量基因组DNA的方法，随后通过氯化铯密度梯度离心进行纯化。
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摘要
摘要
该方法用于从已用储存/裂解缓冲液处理并储存在-80°C的0.22 μm Sterivex滤膜上浓缩的浮游生物生物量中提取高分子量基因组DNA，并通过氯化铯密度梯度纯化该DNA。本方案首先进行两个各一小时的孵育步骤，以释放细胞中的DNA并去除RNA。随后进行一系列苯酚:氯仿和氯仿抽提，并通过离心去除蛋白质和细胞膜组分，收集水相DNA提取物，并通过多次缓冲液置换步骤对提取物进行洗涤和浓缩。第五部分描述了可选的氯化铯密度梯度纯化步骤。建议每次处理少于15个样本，以避免混淆并缩短操作时间。本方案所需的总时间取决于待提取样本的数量。对于10至15个样本，且假定具备适当的离心设备，整个流程应耗时3天。请确保在实验开始前已将杂交炉预热至设定温度。
方案
注意：本方案中使用的所有试剂均从实验室原液分装为较小体积的工作液——这对于避免DNA样本之间的交叉污染以及防止实验室原液被污染至关重要。此外，在移液操作时，每次加样都必须更换移液器吸头，以避免交叉污染。
第一部分：细胞裂解与消化
- 首先将含有先前浓缩浮游生物量的 Sterivex 滤器在冰上解冻，以启动本实验方案。为简便起见，此处以单个滤器的处理流程为例进行说明。实际操作中，建议每次处理不超过 16 个滤器。
- 待滤器完全解冻后，开始进行两步孵育中的第一步：第一步用于裂解细胞并去除 RNA，第二步用于降解蛋白质。对于第一步孵育，向滤器中加入 100 μl 溶菌酶（125 mg 溶于 1000 μl TE 缓冲液）和 20 ml 核糖核酸酶 A（RNase A，10 μg/ml）。用 Parafilm 密封滤器，置于杂交炉中 37°C 下旋转孵育 1 小时。
- 进行下一步孵育时，向滤器中加入 100 μl 蛋白酶 K 和 100 μl 20% 十二烷基硫酸钠（SDS）。再次用 Parafilm 密封，置于杂交炉中 55°C 下继续旋转孵育 1 至 2 小时。
- 使用 5 cc 注射器将裂解液从 Sterivex 滤器转移至 15 ml Falcon 管中。用 1 ml 裂解缓冲液冲洗滤器，并使用 5 cc 注射器将冲洗液加入 Falcon....
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讨论
根据待处理样本的数量，该实验过程可能耗时较长，因为包含两个一小时的孵育步骤，以及多次洗涤和离心步骤。建议为此实验安排完整的两天时间，以确保有充足的操作时间。如果在DNA浓缩和洗涤过程中，难以将Amicon管中的最终提取液体积浓缩至200–500 μL，可尝试增加TE缓冲液洗涤和离心步骤（重复第三部分），直至剩余体积达到要求。此外，如果提取液有明显的氯仿气味，建议继续进行额外的洗涤，直到气味减弱，以确保完全去除氯仿。再次强调，本实验方案中使用的所有试剂均应从实验室储备液中分装为小份工作液，这一点非常重要，可有效避免DNA样本之间的交叉污染以及对实验室储备液的污染。同时，在移液操作中，每次添加试剂时务必更换移液器吸头，以防止交叉污染。
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致谢
我们感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对沿海和开阔海域低氧区域持续研究的支持。J.J.W. 获得了来自 NSERC 的博士后奖学金支持，D.A.W. 获得了来自 NSERC、Killam 以及由 TULA 基金会资助的微生物多样性与进化中心的奖学金支持。S.L. 获得了由 TULA 基金会资助的微生物多样性与进化中心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 cc 注射器（26G5/8 针头） | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml 注射器（26G5/8 针头） | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5 ml 离心管 | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15 ml 管 | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5 cc 注射器 | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 离心过滤装置 | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 标称分子量截留值 |
| 丁醇 | Fisher Scientific | A383-1 | 配制成水饱和丁醇（丁醇:水 = 1:1） |
| 离心机转子，JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| 离心机，Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| 氯化铯 | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| 氯仿:异戊醇（24:1） | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| 溴化乙锭（EtBr） | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 杂交炉 | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| 裂解缓冲液 | 0.75 M 蔗糖，40 mM EDTA，50 mM Tris（pH 8.3） | ||
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg 溶于 1000 μl TE 缓冲液 |
| Microcon® Ultracel YM-30 离心过滤单元 | EMD Millipore | 42410 | 50 bp 截留 |
| Parafilm 封口膜 | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1） | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| 蛋白酶 K | Qiagen | 19133 | |
| 核糖核酸酶 A（RNase A） | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ 蓝光透射仪 | Invitrogen | S37102 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex 滤器 | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5415D | |
| TE 缓冲液，pH 8.0 | |||
| Trizma® 碱 | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| 超速离心机转子，TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| 超速离心管（7×20 mm，PC） | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| 超速离心管架 | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| 超速离心机，Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
参考文献
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
