Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation
Summary
Un guide étape par étape pour générer ciblées embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation au stade blastula ou de gastrula.
Abstract
Un des outils les plus puissants utilisés pour mieux comprendre les processus complexes de développement est l'analyse des embryons chimériques. Une chimère est définie comme un organisme qui contient des cellules de plus d'un animal; mosaïques sont un type de chimère dans laquelle les cellules de plus d'un génotype sont mixtes, généralement de type sauvage et mutant. Dans le poisson zèbre, les chimères peuvent être facilement réalisés par transplantation de cellules d'un embryon donateurs dans un embryon hôte au stade approprié embryonnaire. Les cellules du donneur sont étiquetés produites par injection d'un marqueur de la lignée, comme un colorant fluorescent, dans l'embryon au stade d'une cellule. Les cellules du donneur sont étiquetés prélevées sur des embryons donateurs et introduit dans des embryons hôtes non étiquetés en utilisant une huile à commande pipette en verre montée sur un composé ou soit microscope à dissection. Les cellules donneuses peuvent dans certains cas, être ciblés sur une région spécifique ou un tissu de l'embryon en développement stade blastula ou gastrula d'hôte en choisissant un site de transplantation de l'embryon hôte basées sur des cartes sort bien établi.
Protocol
Discussion
La facilité avec laquelle la transplantation peuvent être utilisées pour produire des chimères ciblé est l'une des grandes puissances du poisson zèbre comme modèle vertébré. Une modification de ce protocole n'est pas décrit ci-dessus permet d'analyser la fonction des gènes maternels pour les gènes ayant un rôle essentiel dans le développement zygotique. Comme ces poissons mutants ne peuvent pas survivre jusqu'à l'âge adulte, il est nécessaire de transférer la lignée germinale dans …
Acknowledgements
Merci aux membres du laboratoire pour l'entrée Moens utiles lors de la rédaction de cet article. HK est stagiaire post-doctoral soutenu par le NIH / NICHD octroi # 5R01HD037909-08. CBM est un enquêteur de la Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
