Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto
Summary
Un passo-passo guida mirate a generare embrioni di zebrafish chimerico da trapianto allo stadio di blastula o gastrula.
Abstract
Uno degli strumenti più potenti utilizzati al fine di conoscere complessi processi di sviluppo è l'analisi degli embrioni chimerici. Una chimera è definito come un organismo che contiene cellule provenienti da più di un animale, mosaici sono un tipo di chimera in cui si mescolano le cellule da più di un genotipo, di solito wild-type e mutanti. In zebrafish, chimere può essere facilmente fatto con il trapianto di cellule da un embrione donatore in un embrione di ospitare allo stadio embrionale appropriato. Cellule del donatore etichettati sono generati mediante iniezione di un marker lignaggio, come ad esempio un colorante fluorescente, in embrione unicellulare palco. Cellule del donatore etichettati vengono rimossi da embrioni donatori e introdotto in embrioni di ospitare senza etichetta utilizzando un olio controllato pipetta di vetro montato sia su un composto o microscopio da dissezione. Cellule del donatore possono in alcuni casi essere mirate ad una specifica regione o tessuto dello sviluppo dell'embrione stadio di blastula o gastrula ospitare scegliendo un sito trapianto di embrione di accoglienza sulla base di consolidata mappe destino.
Protocol
Discussion
La facilità con cui il trapianto può essere usato per produrre chimere mirata è una delle grandi potenze del pesce zebra come modello vertebrato. Una modifica di questo protocollo non sopra descritto permette l'analisi della funzione del gene materno per i geni con ruolo essenziale nello sviluppo zigotico. Dal momento che questi pesci mutanti non possono sopravvivere fino all'età adulta, è necessario trasferire la linea germinale mutante in un altro modo wild-type embrione di accoglienza, la creazione di &q…
Acknowledgements
Grazie ai membri del laboratorio Moens utile per l'ingresso durante la stesura di questo articolo. HK è post-doctoral fellow supportato da NIH / NICHD concedere # 5R01HD037909-08. CBM è un investigatore con l'Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
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