La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante
Summary
Una guía paso a paso para la generación de embriones de pez cebra quimérico dirigido por el trasplante en la fase de blástula o gástrula.
Abstract
Una de las herramientas más poderosas utilizadas para comprender mejor los complejos procesos de desarrollo es el análisis de embriones quiméricos. Una quimera es definido como un organismo que contiene las células de más de un animal, los mosaicos son un tipo de quimera en la que las células de más de un genotipo se mezclan, por lo general de tipo salvaje y mutante. En el pez cebra, las quimeras pueden ser fácilmente realizadas por el trasplante de células de un embrión de donante en un embrión de acogida en la fase embrionaria adecuada. Etiquetados células del donante son generados por la inyección de un marcador de linaje, como un tinte fluorescente, en el embrión en su fase de una célula. Etiquetados células del donante se extraen de embriones de donantes y se introducen en embriones de acogida sin etiquetas usando un aceite con control pipeta de vidrio montado en cualquiera de un compuesto o microscopio de disección. Células del donante pueden, en algunos casos estar dirigida a una región específica o en el tejido del embrión en su fase de desarrollo de host blástula o gástrula por elegir un sitio en el trasplante de embriones de acogida sobre la base de los mapas de destino bien establecido.
Protocol
Discussion
La facilidad con que el trasplante se puede utilizar para producir quimeras objetivo es una de las grandes potencias del pez cebra como modelo de vertebrados. Una modificación de este protocolo no se ha descrito anteriormente permite el análisis de la función de genes maternos de los genes con un papel esencial en el desarrollo del zigoto. Ya que estos peces mutantes no pueden sobrevivir hasta la edad adulta, es necesario transferir la línea germinal mutante en un embrión de lo contrario anfitrión de tipo salvaje,…
Acknowledgements
Gracias a los miembros del laboratorio de Moens para la entrada de ayuda durante la redacción de este artículo. HK es post-doctorado con el apoyo de NIH / NICHD subvención # 5R01HD037909-08. CBM es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
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