Het genereren van Chimère zebravis embryo's door transplantatie
Summary
Een stap-voor-stap handleiding voor gerichte chimerisch zebravis embryo's genereren door transplantatie op de blastula of gastrulastadium.
Abstract
Een van de meest krachtige tools gebruikt worden om inzicht te krijgen in complexe ontwikkelingsprocessen is de analyse van chimeer embryo's. Een chimera is gedefinieerd als een organisme dat cellen van meer dan een dier bevat; mozaïeken zijn een soort van chimera waarbij cellen van meer dan een genotype worden gemengd, meestal wild-type en mutant. In de zebravis, kan chimeren gemakkelijk worden gemaakt door transplantatie van cellen van een donor embryo in een gastheer embryo op het juiste embryonale stadium. Gelabelde donor cellen worden gegenereerd door injectie van een geslacht marker, zoals een fluorescente kleurstof, in de een-cellig stadium embryo. Gelabelde donor cellen worden verwijderd uit donor embryo's en geïntroduceerd in ongelabelde gastheer embryo's met behulp van een olie-gecontroleerde glazen pipet gemonteerd op ofwel een verbinding of dissectiemicroscoop. Donor cellen kunnen in sommige gevallen worden gericht op een specifieke regio of weefsel van de zich ontwikkelende blastula of gastrulastadium gastheer embryo door te kiezen voor een transplantatie plaats in de ontvangende embryo op basis van gerenommeerde lot kaarten.
Protocol
Discussion
Het gemak waarmee transplantatie kunnen worden gebruikt om meer gerichte hersenschimmen produceren is een van de grote bevoegdheden van de zebravis als een gewerveld dier model. Een wijziging van dit protocol niet hierboven beschreven staat de analyse van de moeder genfunctie voor de genen met een essentiële rol in zygotische ontwikkeling. Aangezien deze mutant vissen niet kunnen overleven tot volwassen leeftijd, is het noodzakelijk om de mutant germinale te zetten in een anders wild-type gastheer embryo, het creëren …
Acknowledgements
Met dank aan de leden van de Moens lab voor nuttige inbreng tijdens het schrijven van dit artikel. HK is post-doctoraal onderzoeker ondersteund door NIH / NICHD verlenen # 5R01HD037909-08. CBM is een onderzoeker met de Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
