Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation
Summary
Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für gezielte chimären Zebrafischembryonen durch die Transplantation erzeugt an der Blastula oder Gastrula-Stadium.
Abstract
Eines der mächtigsten Werkzeuge verwendet werden, um Einblick in die komplexen Entwicklungsprozesse zu gewinnen ist die Analyse von chimären Embryonen. Eine Chimäre ist ein Organismus, der Zellen, die aus mehr als ein Tier enthält definiert; Mosaike sind eine Art von Chimären, in denen Zellen von mehr als einem Genotyp gemischt, sind in der Regel Wildtyp und Mutante. In der Zebrafisch, können Chimären leicht durch die Transplantation von Zellen eines Spenders Embryo in eine Host-Embryo in den entsprechenden embryonalen Stadium vorgenommen werden. Labeled Spender-Zellen werden durch Injektion von einer Linie Marker, wie zum Beispiel einem fluoreszierenden Farbstoff, in den ein-Zell-Stadium Embryos erzeugt. Labeled Spenderzellen sind vom Spender Embryonen entnommen und in unbeschrifteten Host Embryonen mit einem Öl-gesteuerte Glaspipette auf entweder eine Verbindung oder Präpariermikroskop montiert. Donor-Zellen können in einigen Fällen auf eine bestimmte Region oder Gewebe des sich entwickelnden Blastula oder Gastrula-Stadium Host Embryo durch die Wahl einer Transplantation vor Ort in den Host-Embryo auf etablierte Schicksal Karten basieren ausgerichtet sein.
Protocol
Discussion
Die Leichtigkeit, mit der Transplantation verwendet werden, um gezielte Chimären hergestellt werden können, ist eine der großen Mächte der Zebrafisch als Modell Wirbeltiere. Eine Modifikation dieses Protokoll nicht oben beschrieben ermöglicht die Analyse der mütterlichen Genfunktion für Gene, die mit wesentlichen Rollen in zygotischen Entwicklung. Da diese Mutanten Fische können nicht bis ins Erwachsenenalter überleben, ist es notwendig, die Mutante Keimbahn in einen ansonsten Wildtyp-Host-Embryo-Transfer, die …
Acknowledgements
Dank den Mitgliedern des Moens Labor für hilfreiche Eingang beim Schreiben dieses Artikels. HK ist Postdoktorand von NIH / NICHD gewähren # 5R01HD037909-08 unterstützt. CBM ist ein Ermittler mit dem Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
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