Generera chimär Zebrafish embryon genom transplantation
Summary
En steg-för-steg guide för att skapa riktade chimär zebrafisk embryon genom transplantation vid blastula eller gastrulastadium.
Abstract
En av de mest kraftfulla verktyg som används för att få insikt i komplexa utvecklingsprocesser är analysen av chimära embryon. En chimär definieras som en organism som innehåller celler från mer än ett djur, mosaiker är en typ av chimera där celler från mer än en genotyp är blandade, oftast vildtyp och mutant. I zebrafisk kan chimärer lätt göras av transplantation av celler från en donator embryo till en värd embryo vid lämplig fosterstadiet. Märkta donator celler skapas genom injektion av en härstamning markör, t.ex. en fluorescerande färg, i en-cells stadiet embryo. Märkta donator celler avlägsnas från givare embryon och förs in omärkta värd embryon med hjälp av en olje-kontrollerad glaspipett monterade på antingen en förening eller dissekera mikroskop. Donator celler kan i vissa fall riktas till en viss region eller vävnad av utvecklingsländerna blastula eller gastrula stage värd embryo genom att välja en transplantation plats i den mottagande embryot baserade på väletablerade öde kartor.
Protocol
Discussion
Den lätthet med vilken transplantation kan användas till att utarbeta målinriktad chimärer är en av stormakterna i zebrafisk som ryggradsdjur modell. En ändring av detta protokoll inte beskrivs ovan möjliggör analys av moderns geners funktion för att gener med viktiga roller i zygotic utveckling. Eftersom dessa muterade fiskar inte kan överleva till vuxen ålder, är det nödvändigt att överföra muterade könsceller in i en annars vildtyp värd embryo, skapa "könsceller kloner" av muterade celler…
Acknowledgements
Tack vare medlemmarna i Moens labb för bra insatser under skrivandet av denna artikel. HK är forskarassistent stöds av NIH / NICHD bevilja # 5R01HD037909-08. CBM är en utredare med Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
References
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
