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Neuroscience

दो-फोटॉन पॉलिमराइजेशन 3 डी-माइक्रो-स्केल न्यूरोनल सेल कल्चर डिवाइसेस की प्रिंटिंग

Published: June 7, 2024 doi: 10.3791/66142
Automatic Translation
1, 2, 1
1Neuroscience Department, International School for Advanced Studies, 2Mathematics Department, International School for Advanced Studies

Summary

माइक्रोमीटर पैमाने पर 3 डी प्रिंटिंग न्यूरोनल सेल संस्कृतियों के लिए बहुलक उपकरणों के तेजी से प्रोटोटाइप को सक्षम बनाता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, न्यूरॉन्स के बीच संरचनात्मक कनेक्शन न्यूराइट आउटग्रोथ को प्रभावित करने वाले अवरोधों और चैनलों को बनाकर विवश थे, जबकि इस तरह के हेरफेर के कार्यात्मक परिणाम बाह्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा देखे गए थे।

Abstract

न्यूरोनल संस्कृतियां कई दशकों से एक संदर्भ प्रयोगात्मक मॉडल रही हैं। हालांकि, 3 डी सेल व्यवस्था, न्यूराइट आउटग्रोथ पर स्थानिक बाधाएं, और यथार्थवादी सिनैप्टिक कनेक्टिविटी गायब हैं। उत्तरार्द्ध कम्पार्टमेंटलाइजेशन के संदर्भ में संरचना और कार्य के अध्ययन को सीमित करता है और तंत्रिका विज्ञान में संस्कृतियों के महत्व को कम करता है। पूर्व विवो का अनुमान लगाना सिनैप्टिक कनेक्टिविटी की संरचित शारीरिक व्यवस्था तुच्छ नहीं है, लय, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और अंततः, मस्तिष्क पैथोफिज़ियोलॉजी के उद्भव के लिए महत्वपूर्ण होने के बावजूद। यहां, दो-फोटॉन पोलीमराइजेशन (2 पीपी) को 3 डी प्रिंटिंग तकनीक के रूप में नियोजित किया जाता है, जो माइक्रोमीटर पैमाने पर पॉलीडिमिथाइल-सिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके बहुलक सेल संस्कृति उपकरणों के तेजी से निर्माण को सक्षम करता है। माइक्रोफोटोलिटोग्राफी पर आधारित पारंपरिक प्रतिकृति मोल्डिंग तकनीकों की तुलना में, 2 पीपी माइक्रो-स्केल प्रिंटिंग प्रोटोटाइप के तेजी से और सस्ती बदलाव को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मॉड्यूलर न्यूरोनल नेटवर्क की खेती के उद्देश्य से पीडीएमएस-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के डिजाइन और निर्माण को दर्शाता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, एक दो-कक्ष उपकरण शारीरिक रूप से कनेक्टिविटी को बाधित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। विशेष रूप से, पूर्व विवो विकास के दौरान एक असममित अक्षीय प्रकोप का पक्ष लिया जाता है और एक कक्ष से दूसरे कक्ष में निर्देशित होने की अनुमति दी जाती है। यूनिडायरेक्शनल सिनैप्टिक इंटरैक्शन के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए, वाणिज्यिक माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों को परस्पर जुड़े न्यूरोनल मॉड्यूल की बायोइलेक्ट्रिकल गतिविधि की निगरानी के लिए चुना जाता है। यहां, 1) माइक्रोमीटर परिशुद्धता के साथ नए नए साँचे बनाने के तरीके और 2) चूहे कॉर्टिकल न्यूरोनल संस्कृतियों में इन विट्रो मल्टीसाइट बाह्य रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन करते हैं। लागत में कमी और 2PP 3D-प्रिंटिंग की भविष्य की व्यापक पहुंच से, यह विधि दुनिया भर में अनुसंधान प्रयोगशालाओं में अधिक से अधिक प्रासंगिक हो जाएगी। विशेष रूप से न्यूरोटेक्नोलॉजी और उच्च-थ्रूपुट तंत्रिका डेटा रिकॉर्डिंग में, इन विट्रो मॉडल में सरलीकृत प्रोटोटाइप की आसानी और कठोरता प्रयोगात्मक नियंत्रण और विवो बड़े पैमाने पर तंत्रिका प्रणालियों की सैद्धांतिक समझ में सुधार करेगी।

Introduction

जीवों के व्यवहार में न्यूरोनल गतिविधि की जांच करना कई चुनौतियां प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों तक भौतिक पहुंच इसकी अखंडता को बनाए रखने की आवश्यकता से सीमित है, इसलिए मस्तिष्क के सतही क्षेत्रों को अधिक आसानी से माना जाता है। बरकरार ऊतक के भीतर विशिष्ट लक्ष्यों को अलग करना अक्सर एक कठिन काम होता है और कभी-कभी असंभव होता है। यद्यपि अलग-अलग सजातीय न्यूरोनल संस्कृतियां एक तंत्रिका सर्किट के व्यक्तिगत (उप) सेलुलर घटकों के आणविक, जैव रासायनिक और बायोफिजिकल गुणों तक सुविधाजनक पहुंच प्रदान करती हैं, एक यथार्थवादी कनेक्टिविटी और बरकरार मस्तिष्क का शारीरिक संगठन खो जाता है। इन मूलभूत बाधाओं ने एक मध्य जमीन को प्राप्त करने के लिए अनुसंधान प्रयासों को प्रेरित किया, जहां विवो जटिलता से बचा जाता है, जबकि संरचना का निर्माण इन विट्रो में किया जा सकता है, जोमांग पर है 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . विशेष रूप से, मॉड्यूलर न्यूरोनल संस्कृतियां पिछले दशकों में व्यापक शोध का विषय रही हैं, जिसका उद्देश्य नीचे वर्णित मस्तिष्क शरीर विज्ञान के प्रमुख प्रश्नों से निपटना है।

संगठन: विवो अध्ययनों से पता चलता है कि मस्तिष्क को सटीक सेल प्रकारों और अनुमानों के सरणियों के साथ परतों में संरचनात्मक रूप से संरचित किया जाता है। कार्यात्मक assays सटीक कनेक्टिविटी योजनाओं10,11 के साथ, नोड विधानसभाओं और मॉड्यूल में न्यूरोनल नेटवर्क के संगठन का पता चला. कनेक्टिविटी और माइक्रोक्रिकिट रूपांकनों की भूमिका, हालांकि, विवो में पर्याप्त रूप से अध्ययन नहीं किया जा सकता है, जिसमें शामिल सिनैप्स की सरासर संख्या के साथ-साथ विकास और गतिविधि-निर्भर प्लास्टिसिटी के इंटरवॉवन प्रभाव भी शामिल हैं।

संकेत स्थानांतरण: इन विवो या यादृच्छिक इन विट्रो संस्कृतियों में , सिग्नल ट्रांसफर का आकलन करना चुनौतीपूर्ण है। इसकी लंबाई के साथ अक्षीय चालन और कार्रवाई क्षमता की जांच करने के लिए सतह कार्यात्मकता या रासायनिक पैटर्निंग द्वारा न्यूराइट आउटग्रोथ का मार्गदर्शन करने की आवश्यकता होती है, जो विद्युत गतिविधि12 के बाह्य रीडआउट में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है।

अनुवादीय प्रासंगिकता: पैथोलॉजिकल स्थितियों में पूर्व-बनाम पोस्ट-सिनैप्टिक तत्वों की अनन्य भूमिका को समझने के लिए इन तत्वों तक व्यक्तिगत रूप से पहुंच की आवश्यकता होती है। विवश कनेक्टिविटी के साथ मॉड्यूलर संस्कृतियों, प्रभावी ढंग से पूर्व और बाद synaptic तत्वों को अलग, इस अंत13 के लिए अपरिहार्य उपकरण हैं.

न्यूरोनल संस्कृति में संरचना के कुछ रूप प्राप्त करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं। उन्हें मोटे तौर पर रासायनिक और भौतिक सतह हेरफेर 9 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकताहै। पूर्व तरीकों14,15 कुछ (जैव) रासायनिक यौगिकों को संलग्न करने के लिए न्यूरोनल कोशिकाओं की प्रवृत्ति पर भरोसा करते हैं. इसके लिए सूक्ष्म पैमाने पर सटीकता के साथ सतह पर चिपकने वाला या आकर्षक अणुओं को जमा करने और एक विस्तृत पैटर्न का पालन करने की आवश्यकता होती है। हालांकि यह वांछित पैटर्न के बाद, कोशिकाओं की सतह के आंशिक कवरेज की अनुमति देता है, रासायनिक तरीकों स्वाभाविक रूप से सीमित हैं और न्यूराइट विकास मार्गदर्शन16 में अपेक्षाकृत कम सफलता दर है. अक्षतंतु दिशात्मकता पर पूर्ण नियंत्रण अक्षीय मार्गदर्शन17 को आकार देने के लिए तदर्थ रसायनों की एक स्थानिक ढाल स्थापित करने की आवश्यकता है. बाद के तरीकों में भौतिक सतह हेरफेर शामिल है और आमतौर पर इन विट्रो में न्यूरोनल नेटवर्क की संरचना के लिए उपयोग किया जाता है। न्यूरोनल कोशिकाओं को ज्यामितीय कारावास, जैसे सूक्ष्म कक्षों, दीवारों, चैनलों, आदि द्वारा वांछित स्थानों पर शारीरिक रूप से विवश किया जाता है, जो पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस)3,5,6,7,18,19,20 जैसे जैव-संगत बहुलक को आकार देते हैं और एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में जम जाते हैं। पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन के लिए वास्तविक विधि नरम फोटोलिथोग्राफी21 है, जहां एक दो-आयामी मुखौटा सूक्ष्म पैमाने पर पैटर्न किया जाता है और यूवी एक्सपोजर पर सिलिकॉन-आधारित सामग्री को चुनिंदा रूप से खोदने के लिए नियोजित किया जाता है। संक्षेप में, एक यूवी-इलाज योग्य राल (यानी, फोटोरेसिस्ट) को स्पिन-कोटिंग के माध्यम से एक सिलिकॉन वेफर पर लेपित किया जाता है, जो इसकी चिपचिपाहट और कताई गति द्वारा निर्धारित एक विशिष्ट ऊंचाई तक पहुंचता है। फिर, पैटर्न वाला मुखौटा फोटोरेसिस्ट के ऊपर स्थित होता है और यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है। मुखौटा के भीतर पारदर्शी क्षेत्रों, ब्याज के क्षेत्रों के अनुरूप, यूवी प्रकाश photoresist अणुओं के स्थानीयकृत crosslinking प्रेरित करते हैं. अनएक्सपोज़्ड फोटोरेसिस्ट के क्षेत्रों को एक विलायक का उपयोग करके धोया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक मास्टर मोल्ड का निर्माण होता है। इसका उपयोग बार-बार पसंद के इलास्टोमर (यानी, पीडीएमएस) को सेंकने के लिए किया जाता है, जिसे बाद में वांछित प्रतिकृतियों में वांछित ज्यामिति के साथ उत्कीर्ण किया जाता है। इस तरह के एक विनिर्माण विधि microfluidic उपकरणों22 fabricate करने के लिए सबसे आम विधि है. शायद नरम फोटोलिथोग्राफी की मुख्य सीमाएं उल्लेखनीय पूंजी निवेश की शर्त और आवश्यक तकनीकों और विशेषज्ञता के साथ जैविक प्रयोगशालाओं की अपरिचितता हैं। मुखौटा की तैयारी और जटिल बहु-ऊंचाई उच्च पहलू अनुपात ज्यामिति डिजाइन करने के लिए आवश्यक नरम फोटोलिथोग्राफी के कदम गैर-तुच्छ23 हैं और अक्सर आउटसोर्सिंग की आवश्यकता होती है। भले ही वैकल्पिक और कम बजट के तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, वे हमेशा जैविक प्रोटोटाइप24 की उच्च परिशुद्धता आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते हैं।

यहां, एक वैकल्पिक विनिर्माण विधि प्रस्तुत की जाती है, जो दो-फोटॉन पोलीमराइजेशन (2 पीपी) और योजक विनिर्माण पर निर्भर करती है। यह सीधा है और प्रति से उन्नत माइक्रोफैब्रिकेशन और माइक्रोफोटोलिटोग्राफी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है। 2PP micromanufacturing के अनुसंधान क्षेत्र देर से 9025 में उभरा, और तब से, यह घातीय वृद्धि26 देखा गया है. इस तकनीक के मौलिक सिद्धांतों के बारे में अधिक कहीं और पाया जा सकताहै 26. संक्षेप में, तीन आयामी अंतरिक्ष में उत्तेजना प्रकाश आवेग पर ध्यान केंद्रित करके, 2PP तीव्रता पर मल्टीपोटन अवशोषण की nonlinear निर्भरता का लाभ उठाता है. यह सीमित अवशोषण की क्षमता प्रदान करता है, बहुत स्थानीय क्षेत्रों के भीतर सटीक और चयनात्मक उत्तेजना सुनिश्चित करता है। संक्षेप में, एक नकारात्मक टोन photoresist, प्रकाश जोखिम पर कम घुलनशीलता के साथ एक सामग्री, एक कम कर्तव्य चक्र27 पर femtosecond लेजर दालों के एक केंद्रित बीम के अधीन है. यह कम औसत शक्तियों पर उच्च तीव्रता वाले आवेगों के लिए अनुमति देता है, सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना पोलीमराइजेशन को सक्षम करता है। फोटो-प्रेरित कट्टरपंथी मोनोमर्स की बातचीत कट्टरपंथी ओलिगोमर्स को जन्म देती है, पोलीमराइजेशन की शुरुआत करती है जो पूरे फोटोरेसिस्ट में एक अलग मात्रा तक फैली हुई है, अर्थात, वोक्सेल, जिसका आकारलेजर दालों की तीव्रता और अवधि पर निर्भर करता है।

इस काम में, दो घटक प्रस्तुत किए जाते हैं: ए) 3 डी-मुद्रित मोल्ड का डिजाइन और तेजी से निर्माण, डिस्पोजेबल पॉलिमरिक न्यूरोनल सेल कल्चर डिवाइस(चित्रा 1)का उत्पादन करने के लिए कई बार पुन: प्रयोज्य, और बी) प्लानर न्यूरोनल सेल कल्चर सब्सट्रेट की सतह पर उनके यांत्रिक युग्मन, या यहां तक कि सब्सट्रेट-एकीकृत माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों में भी बायोइलेक्ट्रिक सिग्नल की मल्टीसाइट रिकॉर्डिंग में सक्षम।

एक 3 डी मैकेनिकल मॉडल के कंप्यूटर असिस्टेड डिज़ाइन को यहां बहुत संक्षेप में वर्णित किया गया है और 3 डी-प्रिंटेड मोल्ड और पीडीएमएस उपकरणों को बनाने के लिए अग्रणी चरणों के साथ भी विस्तृत है।

विभिन्न प्रकार के कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोगों का उपयोग शुरुआती 3D ऑब्जेक्ट मॉडल उत्पन्न करने और 2PP प्रिंटिंग प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए STL फ़ाइल बनाने के लिए किया जा सकता है। सामग्री की तालिका के भीतर, सूचीबद्ध पहले और अंतिम आवेदन नि: शुल्क हैं या मुफ्त लाइसेंस के साथ प्रदान किए गए हैं। एक 3D मॉडल के निर्माण के लिए हमेशा एक 2D स्केच बनाने की आवश्यकता होती है, जिसे बाद के मॉडलिंग चरणों में निकाला जाता है। इस अवधारणा को प्रदर्शित करने के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग में एक सामान्य 3 डी सीएडी सॉफ्टवेयर डिजाइन प्रक्रिया पर प्रकाश डाला गया है, जिससे अतिव्यापी क्यूब्स से बना एक संरचना होती है। अधिक व्यापक जानकारी के लिए, कई ऑनलाइन ट्यूटोरियल और मुफ्त प्रशिक्षण संसाधन उपलब्ध हैं, जैसा कि सामग्री की तालिका में दर्शाया गया है।

परिणामी एसटीएल फ़ाइल को तब 3 डी-प्रिंटर (यानी, स्लाइसिंग प्रक्रिया) द्वारा निष्पादित किए जाने वाले आदेशों की एक श्रृंखला में अनुवादित किया जाता है। उपयोग में आने वाले विशिष्ट 2PP 3D-प्रिंटर के लिए, सॉफ़्टवेयर DeScribe का उपयोग STL फ़ाइल को आयात करने और इसे मालिकाना सामान्य लेखन भाषा (GWL) प्रारूप में बदलने के लिए किया जाता है। 2PP प्रिंटिंग प्रक्रिया की सफलता विभिन्न मापदंडों, विशेष रूप से, लेजर पावर और इसकी स्कैन गति, सिलाई और हैचिंग-स्लाइसिंग दूरी पर टिका है। उद्देश्य और फोटोरेसिस्ट के चयन के साथ इन मापदंडों की पसंद, डिजाइन की सबसे छोटी विशेषताओं के साथ-साथ इच्छित अनुप्रयोग पर निर्भर करती है। इस प्रकार, विभिन्न डिजाइन परिदृश्यों और उपयोग के मामलों की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पैरामीटर अनुकूलन आवश्यक हो जाता है। इस काम के लिए, अनुशंसित नुस्खा आईपी-एस 25x आईटीओ शैल (3 डी एमएफ) को मुद्रण मापदंडों के लिए एक कॉन्फ़िगरेशन के रूप में माना गया है। अंततः, एक यंत्रवत् स्थिर मुद्रित भाग को आवश्यक संकल्प के साथ मुद्रित किया जाता है, जबकि इसके 3 डी-प्रिंटिंग समय को कम किया जाता है।

मोल्ड डिजाइन और संबंधित एसटीएल फ़ाइल, इस काम में प्रदर्शित की गई है, जिसमें दो डिब्बों में सेल संस्कृति के स्थान को अलग करने के लिए एक वर्ग फ्रेम शामिल है: एक बाहरी क्षेत्र (यानी, बाद में स्रोत के रूप में संदर्भित) और एक आंतरिक क्षेत्र (यानी, बाद में लक्ष्य के रूप में संदर्भित)। ये दो डिब्बे माइक्रोचैनल्स के सेट के माध्यम से जुड़े हुए हैं, प्रत्येक को तेज-कोण सीमाओं की विशेषता है, जो विशेष रूप से लक्ष्य से स्रोत तक न्यूराइट्स के विकास में बाधा डालने के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन इसके विपरीत नहीं, और इस तरह न्यूरॉन्स के बीच एक दिशात्मक सिनैप्टिक कनेक्टिविटी को बढ़ावा देता है दो क्षेत्रों पर बढ़ रहा है।

पहले के अध्ययनों ने न्यूराइट्स के दिशात्मक विकास को प्रोत्साहित करने के लिए माइक्रोचैनल की विभिन्न ज्यामिति को नियोजित किया। उदाहरणों में त्रिकोणीय आकार18, चैनल कांटेदार संरचनाएं19, और टेपिंग चैनल20 शामिल हैं। यहां, माइक्रोचैनल की सीमाओं के पार तेज कोण बाधाओं की विशेषता वाला एक डिज़ाइन नियोजित है, जो असममित प्रवेश द्वारों की विशेषता भी है। ये माइक्रोचैनल एक संलग्न इंटीरियर, लक्ष्य डिब्बे और बाहरी क्षेत्र, स्रोत डिब्बे के बीच निरंतरता स्थापित करने का काम करते हैं। स्रोत पक्ष से माइक्रोचैनल्स के प्रारंभिक भाग का फ़नल आकार, अक्षीय बंडलों के गठन और सबसे कम, यानी सीधी रेखा, स्रोत को लक्ष्य से जोड़ने वाले पथ के साथ उनकी वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। तेज कोणों का सामना करके महसूस किए गए त्रिकोणीय स्थान में लक्ष्य पक्ष पर बड़ी मात्रा होती है ताकि उपलब्ध स्थान के स्रोत और कब्जे से उत्पन्न होने वाले बंडलों की तेजी से शूटिंग के पक्ष में न्यूराइट्स के पाथफाइंडिंग में प्रभावी ढंग से देरी हो सके। माइक्रोचैनल की लंबाई के लिए 540 माइक्रोन की पसंद प्रभावी रूप से आम तौर पर कम वृक्ष के समान प्रकोप39 को फ़िल्टर करती है। इसके अलावा, उनकी 5 माइक्रोन ऊंचाई सेल सोमाटा को माइक्रोचैनल्स के माध्यम से घुसने से रोकती है। कुल मिलाकर, यह कॉन्फ़िगरेशन बाहरी, स्रोत और आंतरिक, लक्ष्य मॉड्यूल के बीच यूनिडायरेक्शनल कनेक्टिविटी को बढ़ावा देने के लिए साबित हुआ, और इसे यहां कई वैकल्पिक विकल्पों के बीच एक प्रमाण-सिद्धांत के रूप में प्रस्तुत किया गया है।

जबकि पीडीएमएस उपकरणों, 2PP मोल्ड द्वारा निर्मित, इस काम में ग्लास coverslips या पेट्री व्यंजन के रूप में आम सेल संस्कृति सब्सट्रेट, की सतह से जुड़ा जा सकता है, इस काम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सब्सट्रेट-एकीकृत microelectrode सरणियों का इस्तेमाल किया गया. माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी लेआउट के लिए 3 डी डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए कोई प्रयास नहीं किया गया है, और यांत्रिक युग्मन स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी मार्गदर्शन के तहत किया गया था, जिसका उद्देश्य केवल सरणी में डिवाइस की स्थिति को लक्षित करना था, जिससे कुछ माइक्रोइलेक्ट्रोड दोनों पक्षों में खुला रह गया, स्रोत और लक्ष्य। यह न्यूरोनल सेल संस्कृतियों में विवश कनेक्टिविटी के कार्यात्मक परिणामों के प्रारंभिक मूल्यांकन को सक्षम बनाता है।

Protocol

पशु हैंडलिंग से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं यूरोपीय और इतालवी कानूनों (यूरोपीय संसद और 22 सितंबर 2010 [2010/63/ईयू] के परिषद निर्देश) के अनुसार की गईं; 4 मार्च 2014 के इतालवी सरकारी डिक्री, नंबर 26), को स्पष्ट रूप से संस्थागत OpBA (पशु देखभाल समिति) द्वारा Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati में अनुमोदित किया गया था और आधिकारिक तौर पर इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (Auth. No. 22DAB. एन.यूवीडी)। ये इस काम में प्रस्तुत विधि के प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, explanted चूहे मस्तिष्क के ऊतकों से गैर संवेदनशील सामग्री की उपलब्धता के लिए नेतृत्व.

1. 3D दो-फोटॉन पोलीमराइजेशन द्वारा मोल्ड निर्माण

  1. सीएडी फाइलें जनरेट करना
    नोट: निम्नलिखित चरणों में एक सामान्य 3 डी डिजाइन वर्कफ़्लो प्रदर्शित होता है, कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर (यानी, सॉलिडवर्क्स) को नियोजित करता है। इस काम (चित्रा 2) में वर्णित नमूना एसटीएल डिजाइन फ़ाइल पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 के साथ-साथ ज़ेनोडो (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110) के माध्यम से उपलब्ध है।
    1. कंप्यूटर एडेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर डेस्कटॉप एप्लिकेशन लॉन्च करें। शीर्ष मेनू बार से, नया चुनें.
    2. विकल्पों में से, चुनें भाग: एकल डिज़ाइन घटक का 3D प्रतिनिधित्व। कुंजी संयोजन दबाएं Ctrl + 5 स्केच के शीर्ष दृश्य को स्थापित करने के लिए।
    3. साइड पैनल से, स्केच चुनें और कॉर्नर आयत चुनें। आयत के एक किनारे पर क्लिक करके उसका चयन करें। जैसे ही एक पैरामीटर पैनल दिखाई देता है, लंबाई को 100 इकाइयों पर सेट करें।
    4. पिछले एक के लंबवत किनारे के लिए चरण 1.1.3 दोहराएं: इसकी लंबाई 50 इकाइयों पर सेट करें। बाईं माउस बटन दबाए रखते हुए आयत को उस पर खींचकर चुनें।
    5. संबंध जोड़ें मेनू से, रेखाओं के बीच संबंधों को सीमित करने के लिए ठीक करें का चयन करें.
    6. स्केच से बाहर निकलें और पिछले स्केच को ओवरलैप करते हुए, एक नया (छोटा) आयत बनाते हुए, 1.1.3 से 1.1.5 चरण दोहराएं।
    7. साइड पैनल से, सुविधाएँ चुनें, और एक्सट्रूडेड बॉस/बेस चुनें: बड़े और छोटे दोनों आयतों की गहराई को क्रमशः 5 और 10 यूनिट पर सेट करें।
    8. फ़ाइल मेनू से, भाग को एसटीएल प्रारूप (यानी, मानक टेसेलेशन भाषा) में सहेजें।
  2. सीएडी फाइलों को संसाधित करना
    1. STL फ़ाइल को एक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें, जो DeScribe एप्लिकेशन सॉफ़्टवेयर से लैस हो।
    2. Describe लॉन्च करें और इसके फ़ाइल मेनू से, STL फ़ाइल खोलें। मॉडल का एक 3D प्रतिनिधित्व दिखाई देगा।
    3. दाईं ओर के मेनू पर अभिविन्यास अनुभाग से, इसे अंतरिक्ष में उचित रूप से उन्मुख करने के लिए मॉडल को घुमाएं, और इसे विमान में केंद्रित करें।
    4. दाईं ओर के मेनू के स्केलिंग अनुभाग का चयन करके समग्र स्केलिंग समायोजित करें।
    5. शीर्ष पर ड्रॉप-डाउन मेनू से, IP-S 25x ITO Shell (3D MF) रेसिपी चुनें। यह आईपी-एस को फोटोरेसिस्ट के रूप में निर्दिष्ट करता है, उद्देश्य की आवर्धन शक्ति के लिए 25x, इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) मुद्रण सब्सट्रेट के रूप में लेपित सब्सट्रेट, और मध्यम आकार की सुविधाओं (एमएफ) के साथ ऑपरेटिंग मोड के रूप में शेल और पाड़ मुद्रण।
    6. विज़ार्ड के माध्यम से नेविगेट करें, 1 माइक्रोन तक स्लाइसिंग दूरी का चयन और सेटिंग करें और शेल और मचान दोनों के लिए 0.5 माइक्रोन तक हैचिंग दूरी निर्धारित करें।
    7. आयात विज़ार्ड के आउटपुट चरण में, विभाजन के तहत, ब्लॉक आकार को X = 200 μm, Y = 200 μm और Z = 265 μm और ब्लॉक ऑफ़सेट को X = 133 μm, Y = 133 μm, और Z = 0 के रूप में परिभाषित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि माइक्रोचैनल की नाजुक संरचनाएं सिलाई लाइनों से प्रभावित नहीं होती हैं।
    8. स्कैन मोड के रूप में, डिफ़ॉल्ट का उपयोग करें: एक्स-वाई विमान के लिए गैल्वो और जेड-अक्ष के लिए पीजो।
    9. सहेजें दबाएं और, अगले पाठ्य मेनू में, प्रिंट की सबसे निचली परत पर लेजर शक्ति को 75% तक कम करने के लिए, var $baseLaserPower = $shellLaserPower को var $baseLaserPower = 75 से बदलें।
    10. उपरोक्त चरणों द्वारा प्राप्त GWL फ़ाइलों को 2PP 3D प्रिंटिंग के लिए समर्पित वर्कस्टेशन में स्थानांतरित करें।
  3. 3 डी मुद्रण और नमूना विकास
    1. NanoWrite अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर का शुभारंभ. प्रिंटर आरंभीकरण के बाद, सब्सट्रेट धारक को सम्मिलित करने और उद्देश्य को माउंट करने के लिए, सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस पर एक्सचेंज होल्डर पर क्लिक करें।
    2. नोजपीस पर उपयुक्त स्थिति में 25x उद्देश्य माउंट करें। पहचानें कि ग्लास सब्सट्रेट के किस तरफ आईटीओ के साथ लेपित है, प्रतिरोधों को मापने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीमीटर सेट द्वारा: रीडिंग कम मान होनी चाहिए, जैसे कि 100-300 Ω, लेकिन केवल आईटीओ-लेपित पक्ष के लिए।
    3. धारक पर ग्लास सब्सट्रेट स्थिति, आईटीओ-लेपित पक्ष ऊपर की ओर उन्मुख. इसे मजबूती से पकड़ने के लिए टेप का उपयोग करें।
    4. रासायनिक धूआं हुड के तहत, ग्लास सब्सट्रेट के केंद्र में आईपी-एस फोटोरेसिस्ट की एक बूंद लागू करें।
    5. धारक को 3 डी-प्रिंटर में डालें, जिसमें राल ड्रॉप उद्देश्य (यानी, नीचे की ओर) का सामना कर रहा है।
    6. सॉफ़्टवेयर फ़ाइल मेनू के माध्यम से, GWL फ़ाइलों को लोड करें। राल ड्रॉप के करीब उद्देश्य को स्थानांतरित करने के लिए, दृष्टिकोण नमूना का चयन करें।
    7. दो सामग्रियों के अपवर्तन सूचकांक अंतर के आधार पर आईटीओ-फोटोरेसिस्ट प्रिंटिंग इंटरफ़ेस का पता लगाने की अनुमति देने के लिए फाइंड इंटरफेस का चयन करें।
    8. मुद्रण लॉन्च करने के लिए कार्य प्रारंभ करें का चयन करें. जैसे ही मुद्रण समाप्त होता है, धारक को पुनः प्राप्त करने के लिए एक्सचेंज होल्डर दबाएं।
    9. धारक को पुनः प्राप्त करें और मुद्रित भाग के साथ सब्सट्रेट को धीरे से हटा दें। मुद्रित भाग को विकसित करने के लिए, धूआं हुड के नीचे 20 मिनट के लिए प्रोपलीन ग्लाइकोल मिथाइल ईथर एसीटेट (पीजीएमईए) में ग्लास सब्सट्रेट को डुबोएं।
    10. पीजीएमईए से सब्सट्रेट निकालें और इसे 5 मिनट के लिए आइसोप्रोपेनॉल में डुबोएं। मुद्रित भाग को रासायनिक धूआं हुड के नीचे हवा में सूखने दें।
  4. पोस्ट-प्रिंट उपचार और मोल्ड माउंटिंग
    1. 5-20 मिनट के लिए पर्याप्त शक्ति के साथ यूवी प्रकाश (यानी, 365-405 एनएम) के संपर्क में मुद्रित भाग का इलाज करें (बिजली विवरण के लिए चर्चा देखें)।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, धीरे ग्लास सब्सट्रेट से मुद्रित भाग को हटा दें. एक 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश के नीचे राल के ~ 2 माइक्रोन ड्रॉप करें।
    3. मुद्रित भाग को ड्रॉप के ऊपर सावधानी से रखें और राल को भाग के नीचे बहने दें। इसके अलावा 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में आने से मुद्रित भाग का इलाज करें।
    4. पेट्री डिश को अपनी टोपी के साथ कवर करें और इसे गर्मी के इलाज के लिए ओवन में स्थानांतरित करें, 80 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट से अधिक। मुद्रित भाग के विरूपण या फ्रैक्चर से बचने के लिए ओवन को पहले से गरम न करें। इलाज के बाद, मुद्रित भाग स्थायी रूप से पेट्री डिश के नीचे से जुड़ा होगा। अब से, मुद्रित और घुड़सवार भाग को मोल्ड के रूप में संदर्भित किया जाएगा।

2. मोल्ड और सेल कल्चर सब्सट्रेट से पीडीएमएस डिवाइस निर्माण

  1. PDMS डिवाइस निर्माण
    1. आधार के 10: 1 (वजन अनुपात) के 20 एमएल तैयार करें और अनपोलीमराइज्ड पीडीएमएस केइलाज एजेंट का इलाज करें। प्रत्येक डिवाइस के लिए, और इसकी आवश्यक ऊंचाई के आधार पर, पीडीएमएस मिश्रण का 1-2 एमएल पर्याप्त है। बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त unpolymerized PDMS स्टोर करें.
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, अच्छी तरह से 4 मिनट के लिए मिश्रण हलचल. जैसे ही मिश्रण हवा के बुलबुले को समान रूप से फँसाता है, यह अपारदर्शी हो जाएगा।
    3. मिश्रण को 50 माइक्रोन μtube में स्थानांतरित करें और मिश्रण से हवा के बुलबुले को खत्म करने और एक स्पष्ट उपस्थिति प्राप्त करने के लिए, इसे 5 मिन के लिए 168 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
    4. हाइड्रोफोबिंग एजेंट (यानी, रिपेल-सिलेन ईएस) के 10 माइक्रोन के साथ मोल्ड का इलाज करें और इसे 7 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें, बाद में मोल्ड से पॉलिमराइज्ड पीडीएमएस की एक चिकनी टुकड़ी सुनिश्चित करें।
    5. मोल्ड 1x को 70% इथेनॉल से और 2x को विआयनीकृत (DI) पानी से धोएं। मोल्ड लामिना का प्रवाह हुड के तहत हवा सूखी करने के लिए अनुमति दें.
    6. धीरे से पीडीएमएस मिश्रण को मोल्ड पर डालें, जब तक कि डिवाइस की इच्छित अंतिम ऊंचाई तक न पहुंच जाए। हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए, मिश्रण को धीरे से और मोल्ड की सतह के करीब से डालें।
    7. मोल्ड को कवर करें और इसे 18 मिनट के लिए एक ओवन में स्थानांतरित करें जिसे पहले से गरम किया गया है और इलाज के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर किया गया है। 5 मिमी से अधिक और 1 सेमी तक डिवाइस की ऊंचाई के लिए, इलाज का समय 18 से 25 मिनट तक बढ़ाएं।
    8. लामिना का प्रवाह हुड के तहत, धीरे मोल्ड से ठीक पीडीएमएस ब्लॉक अलग और एक गिलास पेट्री डिश के अंदर, कम से कम 10 मिनट के लिए isopropanol में जलमग्न. Isopropanol अनक्रॉसलिंक किए गए PDMS को समाप्त करता है। पीडीएमएस ब्लॉक को हमेशा कवर करके रखें।
    9. आइसोप्रोपेनॉल को नवीनीकृत करें और, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, एक नेत्र छुरा चाकू द्वारा डिवाइस के केंद्रीय वर्ग खंड (इस काम में लक्ष्य क्षेत्र के रूप में पहचाना गया) को ध्यान से काट लें। फिर, डिवाइस के अंतिम आकार को प्राप्त करने के लिए किनारों के साथ और कटौती करने के लिए आगे बढ़ें।
    10. आइसोप्रोपेनॉल से डिवाइस को पुनः प्राप्त करें और इसे 30 मिनट के लिए इथेनॉल में डुबोएं, और फिर इसे बाँझ डीआई पानी के साथ 3x कुल्ला। इस बिंदु से बाँझपन बनाए रखें।
    11. एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत, एक नया पेट्री डिश में डिवाइस हस्तांतरण, अपनी टोपी थोड़ा खुला छोड़ने. इसे पूरी तरह से हवा में सूखने दें।
  2. डिवाइस बढ़ते और सेल संस्कृति substrates तैयारी.
    1. 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में जलमग्न करके प्रत्येक माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) को स्टरलाइज़ करें, और फिर इसे बाँझ डि पानी के साथ 3x कुल्ला।
    2. बाँझ ठीक चिमटी का प्रयोग, एक लामिना का प्रवाह हुड और stereomicroscope के तहत, एक विदेश मंत्रालय के भीतरी क्षेत्र पर PDMS डिवाइस माउंट. सब्सट्रेट-एकीकृत माइक्रोइलेक्ट्रोड की विशेषता वाले आंतरिक विदेश मंत्रालय क्षेत्र के केंद्र में पीडीएमएस डिवाइस के एक तरफ संरेखित करें, ताकि कुछ माइक्रोइलेक्ट्रोड स्रोत और लक्ष्य दोनों क्षेत्रों से खुला छोड़ दिया जाए ( चित्र 2देखें)।
      नोट: इस काम के लिए, विदेश मंत्रालय माइक्रोइलेक्ट्रोड को पीडीएमएस डिवाइस माइक्रोचैनल में संरेखित करना आवश्यक नहीं है। PDMS डिवाइस और MEA सतह के बीच एक तंग सील प्राप्त करने के लिए डिवाइस पर एक कोमल धक्का की आवश्यकता हो सकती है। चिमटी की नोक से माइक्रोइलेक्ट्रोड को छूने के लिए हर कीमत पर बचें।
    3. प्लाज्मा क्लीनर कक्ष में उस पर पीडीएमएस डिवाइस के साथ विदेश मंत्रालय डालें, वायु प्लाज्मा के माध्यम से सतह सक्रियण को सक्रिय करने के लिए। कक्ष के एक 4 मिनट वैक्यूम पंप निकासी के साथ प्रक्रिया शुरू करो. अगला, नियंत्रित हवा के रक्तस्राव की अनुमति देने के लिए वायु वाल्व को थोड़ा खोलें। एयर वाल्व बंद करें और प्लाज्मा इंड्यूसर पर स्विच करें, आरएफ पावर लेवल को 10 डब्ल्यू और 18 डब्ल्यू के बीच समायोजित करें।
    4. एक बार एक चमकती रोशनी दिखाई देने के बाद, प्रक्रिया को 80 s तक चलने दें। फिर, प्लाज्मा इंड्यूसर को बंद करें, वैक्यूम पंप वाल्व बंद करें, और धीरे से एयर वाल्व खोलें। विदेश मंत्रालय को पुनः प्राप्त करने के लिए कक्ष खोलें।
      नोट: यदि प्लाज्मा उपचार में एमईए को गैर-बाँझ वातावरण में उजागर करना शामिल है, तो बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए, 30 मिनट के लिए लामिना का प्रवाह हुड में यूवी प्रकाश के तहत प्रत्येक विदेश मंत्रालय रखें।
    5. विदेश मंत्रालय में पॉलीथीनमाइन (पीईआई) 0.1% डब्ल्यूटी/वॉल्यूम समाधान के 1 एमएल जोड़ें और इसे रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पीईआई समाधान को महाप्राण करें और बाँझ डीआई पानी 5x के साथ कुल्ला। विदेश मंत्रालय के लिए सेल संस्कृति माध्यम के 1 एमएल जोड़ें और सेल बोने से पहले इसे सेते हैं.

3. न्यूरोनल सेल संस्कृति और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. विच्छेदन माध्यम, पाचन समाधान, और समाधान 1-3 ( तालिका 1 देखें) अग्रिम में तैयार करें।
  2. विघटित न्यूरोनल सेल संस्कृति।
    1. धीरे थूथन द्वारा 0-1 दिनों की आयु के एक नवजात Wistar चूहा पिल्ला समझ और कैंची की एक तेज जोड़ी का उपयोग कर तेजी से सिर काटना प्रदर्शन.
    2. खोपड़ी की त्वचा को छीलें, ठीक कैंची का उपयोग करके खोपड़ी की धनु मध्य रेखा के साथ एक चीरा बनाएं, और फिर सेरिबैलम के जंक्शन पर खोपड़ी के माध्यम से एक कोरोनल कट बनाएं।
    3. खोपड़ी निकालें, एक ठीक रंग के साथ मस्तिष्क बाहर स्कूप और यह ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) विच्छेदन माध्यम में हस्तांतरण.
    4. सबकोर्टिकल ऊतक, हिप्पोकैम्पस और मेनिन्जेस को हटा दें। ऊतक को छोटे टुकड़ों (यानी, 1-2 मिमी3) में कीमा बनाएं और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। समाधान त्यागें और ताजा विच्छेदन माध्यम का उपयोग कर ऊतक कुल्ला, पाचन माध्यम के साथ एक धोने के बाद.
    5. पाचन माध्यम त्यागें, फिर समाधान 1 के 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते हैं। समाधान 1 त्यागें और ताजा विच्छेदन माध्यम के साथ ऊतक कुल्ला. फिर समाधान 2 के 1 एमएल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण रखें।
    6. समाधान 2 त्यागें और ताजा विच्छेदन माध्यम का उपयोग कर ऊतक कुल्ला. फिर समाधान 3 के 1 एमएल जोड़ें. यंत्रवत् धीरे ऊपर और नीचे समाधान 20 से 30 बार pipetting द्वारा कोशिकाओं disseciate. के रूप में अलग कोशिकाओं का एक समान रूप से अशांत मिश्रण प्रकट होता है, विच्छेदन माध्यम जोड़कर 3 एमएल के लिए अपनी मात्रा बढ़ा.
    7. 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करके सेल गोली लीजिए। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में सेल गोली resuspend.
    8. कोशिकाओं की गणना करें (यानी, एक सेल-गिनती कक्ष द्वारा) और तदनुसार सेल सीडिंग समाधान के घनत्व को समायोजित करें।
    9. 1.8 x 106 (~ 6500 कोशिकाओं/मिमी2) के नाममात्र सेल घनत्व के साथ 1 एमएल बोने के समाधान के साथ प्रत्येक विदेश मंत्रालय को बीज दें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में बीज वाले एमईए को इनक्यूबेट करें। हर 2 दिनों में ताजा (यानी, साप्ताहिक निर्मित) संस्कृति माध्यम के साथ माध्यम का आदान-प्रदान करें।
  3. एक्स्ट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
    नोट: विघटित न्यूरोनल सेल संस्कृतियों इन विट्रो में 2-3 सप्ताह के बाद पूरी तरह से परिपक्व विद्युत फेनोटाइप तक पहुंचते हैं। निम्नलिखित अनुभाग एक वाणिज्यिक विदेश मंत्रालय अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर (प्रयोगकर्ता) का उपयोग करके एक बाह्य उत्तेजना प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं ताकि मॉड्यूल, यानी स्रोत या लक्ष्य में सुसंस्कृत न्यूरोनल आबादी में से किसी एक को विद्युत रूप से उत्तेजित किया जा सके, जबकि एक साथ परिपक्व नेटवर्क में दोनों आबादी की गतिविधि को रिकॉर्ड किया जा सके।
    1. धीरे मल्टीचैनल इलेक्ट्रॉनिक एम्पलीफायर के हेडस्टेज के अंदर एक विदेश मंत्रालय को माउंट करें, एक सूखी इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) के अंदर और इसे 10 मिनट के लिए समायोजित करने की अनुमति दें। एक कस्टम पीडीएमएस टोपी अलग से गढ़ी जा सकती है और पानी के वाष्पीकरण को कम करने और बाँझपन बनाए रखने के लिए प्रत्येक विदेश मंत्रालय के लिए एक तंग कवर के रूप में उपयोग की जा सकती है।
    2. प्रयोगकर्ता सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। नमूना दर को 25 kHz पर सेट करें और DAQ प्रारंभ करें दबाकर डेटा अधिग्रहण प्रारंभ करें। डेटा डिस्प्ले पैनल में, प्रत्येक चैनल के लिए बाह्य रूप से रिकॉर्ड की गई गतिविधि के कच्चे निशान दिखाई देते हैं।
    3. सहज गतिविधि की निगरानी करें और नेत्रहीन पहचानें और पड़ोसी माइक्रोइलेक्ट्रोड के 3 जोड़े का चयन करें जो नेटवर्क-व्यापी सहज सिंक्रनाइज़ गतिविधि फटने के फटने के दौरान सक्रिय हैं, या तो स्रोत या लक्ष्य पक्ष माइक्रोइलेक्ट्रोड से।
    4. सॉफ्टवेयर के उत्तेजक पैनल में, द्विध्रुवी विन्यास में उत्तेजक माइक्रोइलेक्ट्रोड जोड़े में से प्रत्येक के लिए मापदंडों को कॉन्फ़िगर करें: एक द्विध्रुवीय पल्स तरंग का चयन करें और चोटी के आयामों को ± 800 एमवी और पल्स अवधि को 200 μs पर सेट करें।
    5. उत्तेजना के बाद 1000 एमएस से पहले 300 एमएस की अवधि के लिए रिकॉर्डर और रिकॉर्ड सेट करें।
    6. दोहराव की आवश्यक संख्या के लिए एक interleaved फैशन में स्रोत और लक्ष्य पक्ष के लिए 3.3.3 करने के लिए 3.3.5 कदम दोहराएँ.

Representative Results

2-कम्पार्टमेंट पॉलिमरिक (न्यूरोनल) सेल कल्चर डिवाइस का निर्माण यहां बताया गया है, जो पीडीएमएस उपकरणों के तेजी से प्रोटोटाइप के लिए 2 पीपी 3 डी-प्रिंटिंग के उपयोग का उदाहरण देता है। विशेष रूप से, यूनिडायरेक्शनल सिनैप्टिक कनेक्टिविटी के साथ मॉड्यूलर न्यूरोनल नेटवर्क के लिए एक उपकरण का उत्पादन किया जाता है और इसके कार्यात्मक लक्षण वर्णन को मल्टीसाइट बाह्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के संदर्भ में प्रस्तुत किया जाता है। संक्षेप में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके, प्रत्यक्ष लेजर लेखन के माध्यम से एक माइक्रोमीटर स्केल मोल्ड का एहसास किया गया था। विशेष रूप से, प्रिंटर 780 एनएम के केंद्र तरंग दैर्ध्य और 80 से 100 एफएस की अवधि के साथ लेजर दालों के माध्यम से 50 मेगावाट की शक्ति प्रदान करता है। निर्माण प्रक्रिया के दौरान, लेजर बीम को प्रिंटर के उद्देश्य (25x, NA = 0.8) के माध्यम से नकारात्मक-टोन फोटोरेसिस्ट (IP-S) पर केंद्रित किया जाता है ताकि x और y अक्षों के लिए गैल्वो स्कैनर का उपयोग करके प्रिंटिंग वॉल्यूम को स्कैन किया जा सके, और z अक्ष के लिए पीजो चरण। मुद्रण मात्रा उपयुक्त रूप से 200 मिमी x 200 मिमी x 265 मिमी के ब्लॉकों में विभाजित किया गया था ताकि 6500 मिमी x 6500 मिमी x 545 मिमी के समग्र आकार और 12.423 एमएल की नाममात्र मात्रा के साथ एक मोल्ड का एहसास किया जा सके। चित्रा 2 ए मोल्ड के 2 डी स्केच का प्रतिनिधित्व करता है, इसके आयामों और विशेषताओं के आकार को उजागर करता है, जबकि चित्रा 2 बी एक विदेश मंत्रालय पर घुड़सवार तैयार डिवाइस का क्लोज-अप फोटो दिखाता है। पिछले खंड में वर्णित के रूप में तैयार किए गए मोल्ड टिकाऊ थे और पीडीएमएस उपकरणों को बनाने के लिए 50 से अधिक बार पुन: उपयोग किया जा सकता था।

मुद्रित मोल्ड का उपयोग पीडीएमएस डिवाइस को कास्टिंग करने के लिए किया गया था, जिसे तब माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) के ग्लास-सब्सट्रेट एकीकृत सरणियों के आंतरिक क्षेत्र पर रखा गया था, जिसका उपयोग न्यूरोनल विद्युत गतिविधि के मल्टीसाइट बाह्य रिकॉर्डिंग के लिए और प्रमाण-सिद्धांत के रूप में किया जाता था। वाणिज्यिक सब्सट्रेट-एकीकृत एमईए का उपयोग मॉड्यूलर संस्कृतियों की गतिविधि की निगरानी के लिए किया गया था, जो प्रत्येक संस्कृति डिब्बे में स्थित माइक्रोएलक्रोड के सबसेट द्वारा बाह्य रूप से वितरित स्थानिक रूप से स्थानीयकृत विद्युत उत्तेजनाओं के जवाब में था। प्रत्येक विदेश मंत्रालय में 30 माइक्रोन के व्यास और 100 माइक्रोन इंटर-इलेक्ट्रोड पिच के साथ 120 टाइटेनियम नाइट्रेट (टीआईएन) माइक्रोइलेक्ट्रोड होते हैं। चित्रा 2 सी-डी विदेश मंत्रालय के शीर्ष पर पीडीएमएस डिवाइस की नियुक्ति को दर्शाता है। चित्रा 2 सी में दिखाए गए कक्ष के समग्र पदचिह्न के साथ डिवाइस के व्यक्तिगत माइक्रोचैनल्स की ज्यामितीय विशेषताएं, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के एक कम्पार्टमेंटलाइजेशन की ओर ले जाती हैं। इन्हें उस डिब्बे के आधार पर पहचाना जा सकता है जिससे वे संबंधित हैं, डिवाइस के बाहरी क्षेत्र (स्रोत) में, या डिवाइस के आंतरिक क्षेत्र (लक्ष्य) में। पसंदीदा अक्षीय मार्गदर्शन, स्रोत से लक्ष्य तक सीमित, माइक्रोचैनल के तेज-कोण वाले किनारों द्वारा निर्धारित किया जाता है। चित्रा 2 डी विदेश मंत्रालय पर बहुलक डिवाइस की नियुक्ति और स्रोत या लक्ष्य डिब्बों के भीतर स्थित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के सापेक्ष कवरेज क्षेत्र को दर्शाता है। ध्यान दें कि विदेश मंत्रालय माइक्रोइलेक्ट्रोड की एक या एक से अधिक पंक्तियों के लिए डिवाइस के माइक्रोचैनल्स के अंदर का एक सटीक संरेखण न तो हमारे केस-स्टडी के लिए आवश्यक था और न ही पीछा किया गया था।

असममित न्यूराइट विकास के प्रतिनिधि साक्ष्य चित्रा 3 में प्रदान किए जाते हैं, पूर्व विवो विकास के दौरान, लाइव इमेजिंग में फ्लोरोसेंटली टैग किए गए न्यूराइट, 6 दिन(चित्रा 3ए)और सेल चढ़ाना(चित्रा 3बी-डी)के बाद 2 दिन। जबकि डिवाइस के लक्ष्य पक्ष पर न्यूराइट्स ने तेज कोण बाधाओं का सामना किया क्योंकि अंतरिक्ष के माध्यम से उनकी प्रगति में बाधा उत्पन्न हुई, स्रोत की ओर से उत्पन्न होने वाले न्यूराइट्स निर्बाध रूप से बढ़े और चैनलों को पार कर गए। यह विषमता दो डिब्बों में न्यूरॉन्स के बीच एक यूनिडायरेक्शनल एक्सोनल कनेक्शन का पक्षधर है, जो स्रोत से लक्ष्य तक प्रक्षेपित होता है, जैसा कि डिजाइन से स्पष्ट रूप से इरादा है। इस परिणाम को आगे दो डिब्बों में से प्रत्येक में वैकल्पिक रूप से वितरित उत्तेजनाओं द्वारा उत्पन्न विद्युत प्रतिक्रियाओं के एक (कार्यात्मक) इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा समर्थित किया जाता है।

इन विट्रो में 3-4 सप्ताह के बाद, के रूप में न्यूरोनल नेटवर्क पूर्ण परिपक्वता29,30 तक पहुंच गया, दो डिब्बों भर में कार्यात्मक कनेक्टिविटी संक्षिप्त विद्युत उत्तेजनाओं देने और न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं वे31 पैदा की निगरानी पर जांच की जा सकती है. 800 एमवी के आयाम के साथ द्विध्रुवीय विद्युत आवेगों को वैकल्पिक रूप से केवल स्रोत पर या केवल लक्षित आबादी (एन पुनरावृत्ति = 150, एन मॉड्यूलर संस्कृतियों = 6) पर लागू किया गया था, जो द्विध्रुवी विन्यास में प्लानर माइक्रोइलेक्ट्रोड के 3 रसदार जोड़े द्वारा वितरित किया गया था, और एक इंटरलीव्ड फैशन में। इसलिए, इलेक्ट्रोड के 3 जोड़े विदेश मंत्रालय के स्रोत क्षेत्र के भीतर या विदेश मंत्रालय के लक्ष्य क्षेत्र के भीतर स्थित हो सकते हैं। प्रत्येक उत्तेजना द्वारा उत्पन्न विद्युत प्रतिक्रियाओं को प्रसार देरी के बाद सभी विदेश मंत्रालय माइक्रोइलेक्ट्रोड द्वारा पता लगाया जा सकता है। रिकॉर्डिंग 25 kHz/चैनल की नमूना दर के साथ की गई थी, और परिणामस्वरूप बाह्य कच्चे विद्युत संकेतों को 16 बिट्स के एनालॉग-टू-डिजिटल रूपांतरण रिज़ॉल्यूशन पर डिजिटाइज़ किया गया था। एक थ्रेशोल्ड क्रॉसिंग पीक-डिटेक्शन एल्गोरिथ्म32 का उपयोग किसी भी स्पाइक सॉर्टिंग के बिना, बाह्य कार्रवाई क्षमता की घटनाओं के समय का पता लगाने के लिए ऑफ़लाइन किया गया था। चित्रा 4 ए-बी स्पष्ट रूप से उत्तेजना वितरण के स्थान के आधार पर, 150 बार दोहराया प्रतिक्रियाओं की एक मजबूत विषमता का अनावरण करता है, जो कनेक्टिविटी की पसंदीदा दिशात्मकता पर ज्यामितीय बाधाओं के महत्वपूर्ण कार्यात्मक प्रभाव का सुझाव देता है। वास्तव में, स्रोत पक्ष उत्तेजक पर, स्रोत न्यूरोनल आबादी की फायरिंग दर - पेरी-उत्तेजना स्पाइक-बार हिस्टोग्राम की गणना करके अनुमानित - कार्रवाई क्षमता 33,31,34 का एक पूर्ण नेटवर्क-फट पैदा करने की उम्मीद के रूप में वृद्धि हुई और इसके बाद, देरी के बाद, लक्ष्य आबादी की फायरिंग दर में वृद्धि हुई। हालांकि, जैसा कि लक्ष्य आबादी के भीतर उत्तेजना दी गई थी, केवल लक्ष्य आबादी की फायरिंग दर में वृद्धि हुई और स्रोत आबादी ज्यादातर चुप रही। चित्रा 4 सी-डी एक नियंत्रण संस्कृति में एक ही उत्तेजना / प्रतिक्रिया प्रतिमान को दोहराता है, जिसमें कोई बहुलक उपकरण मौजूद नहीं है (यानी, एक असंरचित न्यूरोनल संस्कृति), बाह्य उत्तेजनाओं को भी 4 पुनरावृत्ति पर वितरित किया गया था। ऐसी नियंत्रण स्थितियों के लिए, किसी भी उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाओं में कोई विषमता नहीं हुई। जबकि एमईए माइक्रोइलेक्ट्रोड का सबसेट मॉड्यूलर नेटवर्क में उपयोग किए जाने वाले उत्तेजनाओं से मेल खाता था, उत्तेजना वितरण के स्थान ने पूरी आबादी से एक समान प्रतिक्रिया पैदा की। यह पुष्टि करता है कि पीडीएमएस डिवाइस ने दो डिब्बों में यूनिडायरेक्शनल सिनैप्टिक कनेक्टिविटी का पक्ष लिया। कुल मिलाकर, मॉड्यूलर संस्कृतियों (एन = 6) में उत्पन्न असममित प्रतिक्रियाएं और नियंत्रण संस्कृतियों (एन = 4) में उत्पन्न सममित प्रतिक्रियाएं दृढ़ता से इन विट्रो प्रणाली में एक कम्पार्टमेंटल की एक विवश शारीरिक कनेक्टिविटी का संकेत देती हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा और चित्रा 4 उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्क्रिप्ट, ज़ेनोडो (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990) के माध्यम से उपलब्ध कराई जाती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: 2 पीपी माइक्रो-मोल्ड निर्माण और पीडीएमएस प्रतिकृति मोल्डिंग का स्केच। (ए) एक 3 डी मॉडल सीएडी में डिज़ाइन किया गया है और मानक टेसेलेशन लैंग्वेज (एसटीएल) प्रारूप फ़ाइल में निर्यात किया गया है, (बी) राल (आईपी-एस) की एक बूंद के भीतर लेजर-प्रेरित पोलीमराइजेशन के माध्यम से अपने 2-फोटॉन 3 डी-प्रिंटिंग का निर्देश देता है। (सी) परिणामी संरचना का उपयोग पीडीएमएस प्रतिकृतियों के बार-बार निर्माण के लिए मोल्ड के रूप में किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक बहुलक (न्यूरोनल) सेल संस्कृति पीडीएमएस डिवाइस के इन-हाउस रैपिड प्रोटोटाइप का उदाहरण। (ए) 24 घंटे से भी कम समय में, माइक्रो-स्केल एडिटिव मैन्युफैक्चरिंग सीएडी मॉडल से 3 डी-प्रिंटेड मास्टर तक जाने की अनुमति देता है, जिसे तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है, और बार-बार, पीडीएमएस जैसे बायोकंपैटिबल इलास्टोमर्स के साथ प्रतिकृति मोल्ड के रूप में। (बी-सी) परिणामी पीडीएमएस उपकरणों को एक न्यूरोनल सेल कल्चर प्लानर सब्सट्रेट के साथ जोड़ा जाता है, यहां माइक्रोइलेक्ट्रोड की एक सरणी द्वारा दर्शाया गया है। (ए) में विशिष्ट नमूना डिजाइन के लिए, दो कक्षों को परिभाषित किया गया है: एक को स्रोत के रूप में संदर्भित किया जाता है और एस द्वारा इंगित किया जाता है, और दूसरे को लक्ष्य के रूप में संदर्भित किया जाता है और टी द्वारा इंगित किया जाता है (डी) प्रत्येक कक्ष में चढ़ाया न्यूरॉन्स केवल माइक्रोचैनल्स की एक श्रृंखला के माध्यम से अपने न्यूराइट्स विकसित कर सकते हैं। जब (सी) में स्टीरियो माइक्रोस्कोपी मार्गदर्शन के तहत उचित रूप से गठबंधन किया जाता है, तो सब्सट्रेट-एकीकृत माइक्रोइलेक्ट्रोड के दो सेट उजागर होते हैं, ताकि दोनों डिब्बों में स्थित आस-पास के न्यूरॉन्स की बायोइलेक्ट्रिकल गतिविधि को उत्तेजित और रिकॉर्ड किया जा सके। यहां ध्यान दें कि अलग-अलग माइक्रोचैनल्स के भीतर माइक्रोइलेक्ट्रोड को संरेखित करना इस प्रूफ-ऑफ-सिद्धांत की प्राथमिकता नहीं थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सेल-इम्पेरमतलब फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणुओं की लाइव इमेजिंग, सेल चढ़ाना के कुछ दिनों बाद, न्यूरॉन्स द्वारा लम्बी न्यूराइट्स की पहचान करता है। (ए-डी) चित्रा 1 और चित्रा 2 (एन = 4, 128 व्यक्तिगत माइक्रोचैनल) से निर्मित डिवाइस के मॉड्यूलर न्यूरोनल संस्कृतियों के प्रतिनिधि कॉन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ कोशिकाओं चढ़ाना के 2 और 6 दिन बाद हासिल किए गए हैं। (बी-डी) 40x आवर्धन और बढ़ी हुई दृश्यता के लिए माइक्रोग्राफ का एक उल्टा ग्रे स्केल। स्रोत और लक्ष्य डिब्बों से माइक्रोचैनल के अंत को क्रमशः एस और टी द्वारा दर्शाया जाता है। (ए) संस्कृति की व्यापक स्कैन छवि दिखाता है, जहां स्रोत (यानी, आंतरिक वर्ग क्षेत्र) और लक्ष्य (यानी, बाहरी क्षेत्र) चढ़ाना के 6 दिन बाद कोशिकाओं से भरे होते हैं। (बी) और (सी) चढ़ाना के बाद 2 दिनों के पहले के समय बिंदु पर, क्रमशः स्रोत पर और माइक्रोचैनल के लक्षित पक्षों पर न्यूराइट्स की वृद्धि प्रदर्शित करते हैं। छोटे काले त्रिकोण ख्यात अक्षतंतु बंडलों टर्मिनलों के प्रतिनिधि उदाहरणों को इंगित करते हैं, जाहिरा तौर पर केवल स्रोत से उत्पन्न होते हैं। तीर के आकार के माइक्रोचैनल की सीमाएं किनारे (बी) के साथ न्यूराइट्स के बढ़ाव की ओर इशारा करती हैं, जहां उनका मार्ग निर्बाध है और लक्ष्य की ओर निर्देशित है। विपरीत दिशा में, और एक माइक्रोचैनल (सी ) के लक्ष्य अंत के बगल में, लक्ष्य से उत्पन्न होने वाले और स्रोत की ओर बढ़ने वाले न्यूराइट्स तेज कोनों पर फंस जाते हैं। (डी) आगे एक माइक्रोचैनल के अंदर न्यूराइट आउटग्रोथ के विवरण का खुलासा करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीडीएमएस डिवाइस के साथ और बिना न्यूरोनल विद्युत प्रतिक्रियाओं का कार्यात्मक लक्षण वर्णन। एमईए का उपयोग सेल संवर्धन सब्सट्रेट के रूप में किया गया था और एक द्विध्रुवी विन्यास में वितरित एक बहुत ही संक्षिप्त (यानी, 200 μs, 0.8V) द्विध्रुवीय विद्युत उत्तेजना नाड़ी द्वारा विकसित नेटवर्क-व्यापी स्पाइकिंग प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए नियोजित किया गया था। चित्रा 2 के PDMS डिवाइस के साथ, स्रोत (लाल) से दर्ज न्यूरोनल स्पाइकिंग प्रतिक्रियाओं और लक्ष्य (नीला) से अलग है, जहां उत्तेजना दिया जाता है पर निर्भर करता है. ख्यात अक्षीय, अन्तर्ग्रथन, और एकीकरण देरी (ए) में स्पष्ट हो जाती है, लेकिन (बी) में नहीं, एक पसंदीदा सिनैप्टिक कनेक्टिविटी (यानी, स्रोत से लक्ष्य तक) मौजूद है। (सी-डी) नियंत्रण स्थितियों के तहत (यानी, कोई पीडीएमएस डिवाइस के साथ), विदेश मंत्रालय माइक्रोइलेक्ट्रोड के दो अलग-अलग सेटों में पाए गए प्रतिक्रियाएं उत्तेजना वितरण स्थान पर निर्भर नहीं करती हैं। भूखंडों में रेखाओं को ढंकने वाला पीला छायांकन, माध्य की तात्कालिक मानक त्रुटि को दर्शाता है (एन उत्तेजनाएं = 150)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान का नाम संयोजन
पॉलीथीनमाइन (पीईआई) 0.1% पीईआई स्टॉक समाधान के 1 एमएल, बाँझ विआयनीकृत (डीआई) पानी के 9 एमएल।
संस्कृति माध्यम (50 एमएल) न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम), 20 माइक्रोन ग्लूकोज, 50 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन, 50 माइक्रोन एल-ग्लूटामाइन, और, 10% हीट-निष्क्रिय हॉर्स सीरम द्वारा पूरक।
विच्छेदन माध्यम (1000 एमएल) हैंक्स ′ संतुलित लवण 9.52 ग्राम, सोडियम बाइकार्बोनेट 350 मिलीग्राम, एचईपीईएस 2.83 ग्राम, डी- (+) - ग्लूकोज 6 ग्राम, किन्यूरेनिक एसिड (अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोन), डी-एपी 5 (अंतिम एकाग्रता 25 माइक्रोन), जेंटामाइसिन 250 μl, बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन 300 मिलीग्राम, मैग्नीशियम सल्फेट 1.44 ग्राम। पीएच को 7.3 में समायोजित करें, प्रकाश से बचाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
पाचन माध्यम (100 एमएल) सोडियम क्लोराइड 800 मिलीग्राम, पोटेशियम क्लोराइड 37 मिलीग्राम, डि-सोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट 99 मिलीग्राम, एचईपीईएस 600 मिलीग्राम, सोडियम बाइकार्बोनेट 35 मिलीग्राम, किन्यूरेनिक एसिड, 200 माइक्रोन (100 एमएम स्टॉक से), डी-एपी 5 100 माइक्रोन (स्टॉक 25 एमएम से)। पीएच को 7.4 में समायोजित करें, प्रकाश से बचाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
समाधान 1 ट्रिप्सिन 5 मिलीग्राम, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिएज I 1.5 मिलीग्राम, पाचन माध्यम के 2 एमएल में।
समाधान 2 ट्रिप्सिन अवरोधक 5 मिलीग्राम, विच्छेदन माध्यम के 5 एमएल में।
समाधान 3 Deoxyribonuclease मैं 1.5 ग्राम, विच्छेदन माध्यम के 2.5 एमएल में.

तालिका 1: समाधान की तालिका। उत्पाद विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: एसटीएल डिजाइन फ़ाइल चित्रा 2 ए में दर्शाई गई संरचना से मेल खाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

दशकों पुराना होने के बावजूद, माइक्रोमीटर-स्केल पीडीएमएस-आधारित प्रतिकृति मोल्डिंग में 2PP प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग हाल ही में43,44 का विकास है। इस संदर्भ में, इस कार्य को प्रभावी ढंग से पुन: प्रस्तुत करने में उपयोगकर्ताओं की सहायता के लिए नीचे बिंदुओं की एक श्रृंखला पर चर्चा की गई है।

3D मॉडल डिज़ाइन के लिए, सुनिश्चित करें कि मॉडल में छेद या स्व-चौराहे नहीं हैं। STL के रूप में सहेजते समय बाइनरी फ़ाइल स्वरूप को विशेषाधिकार दें, ASCII-एन्कोडेड की तुलना में इसके छोटे फ़ाइल आकार के पदचिह्न के लिए। यह जटिल ज्यामिति वाले डिजाइनों और मिलीलीटर-चौड़ी वस्तुओं के लिए विशेष रूप से फायदेमंद है। बाइनरी एसटीएल फ़ाइलों का उपयोग करने का अर्थ कम सीपीयू लोड भी है, बाद में यांत्रिक भाग को 3 डी-मुद्रित करने की प्रक्रिया में तैयार करना। एसटीएल फ़ाइल के भीतर सुविधाओं के भौतिक आयामों को आयामहीन इकाइयों में दर्शाया गया है। एसटीएल फ़ाइल को पोस्टप्रोसेसिंग के दौरान, इकाइयों को माइक्रोमीटर के रूप में व्याख्या की जाती है। इसलिए, फ़ाइल तैयार करते समय ब्याज की इकाई, यानी माइक्रोमीटर को अपनाने की सिफारिश की जाती है। मुद्रित मॉडल की सटीकता टेसेलेटेड त्रिकोण को अनुमानित करने वाली सतहों की संख्या से निर्धारित होती है। सतहों की अपर्याप्त संख्या के लिए, अवांछित सतह खुरदरापन उभरेगा। बहरहाल, बहुत बड़ी संख्या में सतहों द्वारा अत्यधिक उच्च सटीकता का लक्ष्य उच्च कम्प्यूटेशनल लोड की कीमत पर आता है, जिससे फ़ाइल प्रसंस्करण धीमा हो जाता है।

3 डी प्रिंटिंग के लिए, प्रिंटिंग के दौरान, 3 डी भौतिक वस्तु एक्स-वाई विमान में तेज गैल्वो स्कैनिंग और जेड-दिशा में पीजो गति का उपयोग करके बनाई जाती है। यह किसी भी दिए गए 3 डी वोक्सेल के भीतर फेमटोसेकंड लेजर बीम को केंद्रित करता है। हालांकि, जब मुद्रण संरचनाएं गैल्वो और पीजो के स्थानिक कवरेज रेंज से बड़ी होती हैं, तो ऑब्जेक्ट को प्रोग्रामेटिक रूप से ब्लॉक में विभाजित किया जाना चाहिए। हालांकि यह मिलीमीटर आकार के मुद्रित भागों के लिए एक आवश्यकता है, ब्लॉकों के बीच जंक्शन (अपूर्ण) सिलाई लाइनों से जुड़े हैं। ब्लॉक गिनती का सावधानीपूर्वक अनुकूलन और एक्स, वाई, और जेड दिशाओं में सिलाई लाइनों की नियुक्ति सिलाई लाइनों के साथ अंतिम वस्तु की महत्वपूर्ण ज्यामितीय विशेषताओं को बाधित करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। बुलबुले विभिन्न कारणों से प्रिंटिंग इंटरफ़ेस पर बन सकते हैं (उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट फोटोरेसिस्ट की अशुद्धियों और असमानताओं), और मुद्रित संरचना की गुणवत्ता और अखंडता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, उच्च लेजर शक्ति से उनकी घटना में वृद्धि हो सकती है। मुद्रित भाग की सबसे निचली परत पर लेजर शक्ति को कम करना, बुलबुला गठन की संभावना को कम करेगा। एक ठोस संरचना के रूप में पूरे भाग को प्रिंट करने के विकल्प के रूप में, शेल- और-मचान विधि पर विचार किया जा सकता है। इसमें केवल भाग (खोल) की बाहरी सतह के साथ-साथ इसके भीतर त्रिकोणीय प्रिज्म तत्वों को प्रिंट करना शामिल है। इन तत्वों को क्षैतिज परतों (मचान) द्वारा अलग किया जाता है, जो छोटे जेब में अबहुलक राल को पकड़ते हैं। यह विधि मुद्रण समय को काफी कम कर देती है, विशेष रूप से मिलीमीटर-आकार की संरचनाओं के लिए प्रासंगिक है। हालांकि, गैर-बहुलक राल के रूप में, पूर्ण यांत्रिक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए पोस्ट-प्रिंटिंग यूवी एक्सपोजर अनिवार्य है, हालांकि मुद्रित भाग के किसी भी विरूपण से बचने के लिए इस कदम को धीरे से किया जाना चाहिए। इलाज के बाद का समय पसंद की राल, भाग की मोटाई और यूवी पावर40 पर निर्भर करता है। इष्टतम परिणामों के लिए, यूवी एक्सपोजर के बाद, फोटोरेसिस्ट की एक बूंद का उपयोग करके और इसके अनुभाग-कट का मूल्यांकन करते हुए, पूर्ण-गहराई से इलाज के लिए आवश्यक समय का अनुमान लगाने के लिए प्रारंभिक परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। सामान्य इलाज अवधि 5 से 20 मिनट के बीच होती है।

पीडीएमएस प्रतिकृति मोल्डिंग के लिए, माइक्रोमीटर-स्केल सुविधाओं के साथ पीडीएमएस डिवाइस का स्वच्छ निर्माण, बिना किसी साफ-कमरे की सुविधाओं के, चुनौतीपूर्ण हो सकता है: वायु-जनित सूक्ष्म कण पीडीएमएस की अत्यधिक चिपकने वाली सतह पर रह सकते हैं और डिवाइस और सब्सट्रेट के बीच की सील में बाधा डाल सकते हैं, या व्यक्तिगत माइक्रोचैनल के अनुभाग को अवरुद्ध कर सकते हैं। एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत प्रोटोकॉल कदम प्रदर्शन और लगातार isopropanol के साथ PDMS सतह परिरक्षण काफी संदूषण जोखिम को कम करता है. इलाज का तापमान और इसकी अवधि सीधे पीडीएमएस क्रॉस लिंकिंग और परिणामी भौतिक गुणों को प्रभावित करती है। विशेष रूप से, ठीक पीडीएमएस की चिपचिपाहट एक महत्वपूर्ण कारक है। एक ओर, पीडीएमएस डिवाइस के बीच एक तंग सील की आवश्यकता होती है, और न्यूरोनल सेल संवर्धन (जैसे, एक ग्लास कवरस्लिप या एमईए) के लिए उपयोग की जाने वाली सतह, न्यूराइट्स के पारित होने को प्रभावी ढंग से प्रतिबंधित करने के लिए। दूसरी ओर, पीडीएमएस डिवाइस को सतह से उलटा जुड़ना चाहिए, ताकि डिवाइस को हटाने के बाद नाजुक इन्सुलेट परत एमईए क्षतिग्रस्त न हो। जबकि इलाज के दौरान पीडीएमएस संकोचन होता है और मोल्ड को आगे बढ़ाकर ठीक किया जा सकता है, तापमान और इलाज अंतराल के लिए यहां संकेत दिया गया है कि संकोचन 2%42 से कम होगा और एकल-स्तरित पीडीएमएस उपकरणों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करेगा। कुल मिलाकर, सर्वोत्तम परिणामों के लिए अनुशंसित इलाज तापमान और अवधि मूल्यों का सटीक रूप से पालन करें।

विधि के फायदे और सीमाओं का अवलोकन
मॉड्यूलर तंत्रिका नेटवर्क के प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए सूक्ष्म पैमाने पर बहुलक उपकरणों के तेजी से निर्माण के लिए 2-फोटॉन प्रत्यक्ष लेजर लेखन पर आधारित एक तकनीक प्रस्तावित है। सॉफ्ट फोटोलिथोग्राफी के विपरीत, प्रस्तावित दृष्टिकोण के लिए उच्च स्तर की तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है, बशर्ते एक कार्यात्मक 2PP 3D प्रिंटिंग सेटअप सुलभ और परिचालन हो। उल्लेखनीय रूप से, विधि एक ही दिन के भीतर सीएडी-डिज़ाइन किए गए 3 डी मॉडल से एक कार्यात्मक पीडीएमएस डिवाइस तक जाने में सक्षम बनाती है, इस प्रकार अवधारणा से मूर्त प्राप्ति तक एक सीधा और कुशल मार्ग प्रदान करती है। विशेष रूप से, शेल-एंड-मचान प्रिंटिंग मोड का चयन करने से मोल्ड बनाने के लिए आवश्यक समय काफी कम हो जाता है, क्योंकि इसकी मात्रा का केवल एक अंश मुद्रित होता है। मुद्रित घटक के बाद के यूवी-इलाज इसकी यांत्रिक स्थिरता और मजबूती की गारंटी देता है, जैसा कि पीडीएमएस के साथ 50 से अधिक कास्टिंग चक्रों में सत्यापित किया गया है।

पारंपरिक तरीकों की तुलना में, 2PP 3D प्रिंटिंग एक स्पष्ट लाभ का दावा करती है, जो सबसे अधिक स्पष्ट है जब यह एक महत्वपूर्ण पहलू अनुपात, संकल्प आवश्यकताओं की मांग और जटिल त्रि-आयामी ज्यामिति के साथ नए नए साँचे के निर्माण की बात आती है। मानक यूवी लिथोग्राफी का उपयोग कर मास्टर नए नए साँचे का उत्पादन लगभग 200 माइक्रोन की एक प्रतिरोध मोटाई से विवश है. स्पिन-कोटिंग और एक्सपोजर चक्र35, महंगा लीगा (लिथोग्राफी, इलेक्ट्रोप्लेटिंग, और मोल्डिंग), या गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (डीआरआईई) प्रक्रियाओं के जटिल अनुक्रम36 अधिक ऊंचाई और पहलू अनुपात प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। इसके विपरीत, जैसा कि 201037 में कुमी एट अल के अग्रणी काम में दिखाया गया है, 2 पीपी तकनीक मुद्रित भागों के पहलू अनुपात के लिए अनिवार्य रूप से असीम गुंजाइश प्रदान करती है, जो उप-माइक्रोमीटर से मिलीमीटर तक फैली हुई है। यहां, इसके भागों की ऊंचाई में महत्वपूर्ण अंतर के साथ एक मोल्ड की माइक्रोमैनुफैक्चरिंग प्रक्रिया का उदाहरण दिया गया है, जिसमें माइक्रोचैनल्स की ऊंचाई (5 माइक्रोन और अधिकतम मोल्ड की ऊंचाई (545 माइक्रोन; चित्रा 2 देखें) के बीच 100 गुना अंतर है।

इसके अलावा, उप-माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन को उल्लिखित प्रोटोकॉल विनिर्देशों का पालन करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। इसकी तुलना में, यूवी फोटोलिथोग्राफी के माध्यम से बढ़ाया मोल्ड संकल्प प्राप्त करना पूंजी निवेश की मांग करता है। बेहतरीन संकल्प के साथ मास्क, 600 एनएम के नाममात्र संकल्प पर क्वार्ट्ज पर क्रोमियम जमाव का उपयोग, लेजर मुद्रित ओवरहेड पारदर्शिता मास्क, जो 250 माइक्रोन35 के एक संकल्प के अधिकारी की तुलना में अधिक परिमाण के कई आदेश की कीमत है, हालांकि Pirlo एट अल.41 के काम को देखें. इन-हाउस उपयोग के लिए व्यवहार्य होने के लिए, एक चुनी हुई विधि लागत प्रभावी होनी चाहिए। कई जैविक प्रयोगशालाओं के लिए, पारंपरिक नरम फोटोलिथोग्राफी या प्रत्यक्ष लेजर लेखन से जुड़ा समग्र व्यय एक बाधा प्रस्तुत करता है। हालांकि आवश्यक घटकों को खरीदकर और इकट्ठा करके दोनों तकनीकों को अधिक सुलभ बनाना संभव है, यह दृष्टिकोण अतिरिक्त विशेषज्ञता की मांग करता है और अभी भी एक उल्लेखनीय निवेश की आवश्यकता है। इस संदर्भ में, विचार करने के लिए एक आवश्यक बिंदु प्रत्यक्ष लेजर लेखन के माध्यम से प्राप्त अनुप्रयोगों का व्यापक स्पेक्ट्रम है। पारंपरिक नरम फोटोलिथोग्राफी के विपरीत, मुख्य रूप से मोल्ड माइक्रोमैन्युफैक्चरिंग तक सीमित, 2 पीपी 3 डी प्रिंटिंग उल्लेखनीय बहुमुखी प्रतिभा प्रदर्शित करती है। इसके संभावित अनुप्रयोग माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रो-ऑप्टिक्स से लेकर एकीकृत फोटोनिक्स और माइक्रोमैकेनिक्स तक फैले हुए हैं। यह इस तकनीक में निवेश को कई और विविध वैज्ञानिक क्षेत्रों के लिए एक साझा सुविधा के रूप में आकर्षक बनाता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में तैयार 2PP आधारित पद्धति हमारी संस्था के भीतर तंत्रिका विज्ञान और गणित विभागों के बीच एक अंतःविषय सहयोग का परिणाम है। इसके अतिरिक्त, फोटोरेसिस्ट विकास अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है, और संभावित रूप से 2PP 3D प्रिंटिंग के अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार कर सकता है। बिंदु में एक मामला आईपी-पीडीएमएस राल का हालिया परिचय है। पीडीएमएस38 जैसे गुणों के साथ संरचनाओं में पोलीमराइज़ करके, यह राल जैव-संगत घटकों के प्रत्यक्ष माइक्रोफैब्रिकेशन की क्षमता को अनलॉक करता है जिसमें जटिल सतह होती है या खोखले स्थान होते हैं। ये पेचीदगियां पारंपरिक प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रियाओं के माध्यम से समान परिणामों को प्राप्त करने के लिए बाधाओं के रूप में खड़ी हैं।

इस पद्धति के प्रदर्शन के रूप में, एक मॉड्यूलर न्यूरोनल नेटवर्क में दो मॉड्यूल के बीच यूनिडायरेक्शनल कनेक्टिविटी के विकास का सुझाव देते हुए सबूत प्रदान किए गए थे। 2PP तकनीक द्वारा निर्मित माइक्रो-स्केल मोल्ड में कई PDMS कास्टिंग से गुजरने के लिए पर्याप्त धीरज था, और इसमें आवश्यक माइक्रो-स्केल परिशुद्धता है। अंत में, इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल के आवेदन का दायरा सचित्र मामले से परे फैली हुई है। जैसे-जैसे 2PP प्रिंटिंग तकनीक तक पहुंच तेजी से व्यापक होती जा रही है, इसके कार्यान्वयन के लिए आवश्यक प्रारंभिक निवेश कम हो जाएगा जबकि इसके संभावित अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार होगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एमजी यूरोपीय नवाचार परिषद (IN-FET परियोजना, GA n 862882, आर्बर-आईओ परियोजना, FLAG-ERA और मानव मस्तिष्क परियोजना, आईडी 650003) और SISSA (तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र) के माध्यम से यूरोपीय संघ के H2020 फ्रेमवर्क कार्यक्रम से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है। G.N. इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (MUR) से अनुदान Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (गणित क्षेत्र) के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है। हम M. Gigante, B. Pastore, और M. Grandolfo को 3D प्रिंटिंग, सेल कल्चरिंग और लाइव-इमेजिंग के साथ-साथ Drs. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente, और H.C. Schultheiss को चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशन के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 650447
BB cure compact polymerizer PCube Srl Wavelengths 365-405 nm, Power 120W
BioMed Amber Resin 1 L formlabs Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418
CAD application software SolidWorks Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US).
                                 --------------------------------------
Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Trainings: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDA Invitrogen C7025
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
D-AP5 Tocris #0106
Deoxyribonuclease I Sigma-Aldrich D5025
DeScribe Nanoscribe GmbH & Co. KG
di-Sodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 106585
Gentamicin Thermo Fisher 15710049
Hanks′ Balanced Salts Sigma-Aldrich H2387
HEPES Sigma-Aldrich H7523
Horse Serum Sigma-Aldrich H1138
in vitro MEA recording system MEA2000 mini Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
IP-S Photoresist Nanoscribe GmbH & Co. KG
Kynurenic acid Sigma-Aldrich K3375
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643
MEA recording application software (Experimenter) Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany
Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich 51412C
NanoWrite Nanoscribe GmbH & Co. KG
ophthalmic stab Knife 15° HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer Nanoscribe GmbH & Co. KG SN617
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA
Poly(ethyleneimine) solution Sigma-Aldrich P3143
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) Sigma-Aldrich 484431
Repel-silane ES Sigma-Aldrich GE17133201
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL Nanoscribe GmbH & Co. KG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm
SYLGARD 184 Kit Dow Corning
Trypsin Sigma-Aldrich T1005
Trypsin inhibitor Sigma-Aldrich T9003
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles  CIMAMOTORI

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तंत्रिका विज्ञान अंक 208
दो-फोटॉन पॉलिमराइजेशन 3 डी-माइक्रो-स्केल न्यूरोनल सेल कल्चर डिवाइसेस की प्रिंटिंग
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Hosseini, A., Noselli, G.,… More

Hosseini, A., Noselli, G., Giugliano, M. Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices. J. Vis. Exp. (208), e66142, doi:10.3791/66142 (2024).

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