Summary
3D-utskrift på mikrometerskala muliggjør rask prototyping av polymere enheter for nevroncellekulturer. Som et prinsippbevis ble strukturelle forbindelser mellom nevroner begrenset ved å skape barrierer og kanaler som påvirket nevrittutvekst, mens de funksjonelle konsekvensene av slik manipulasjon ble observert ved ekstracellulær elektrofysiologi.
Abstract
Nevrale kulturer har vært en referanseeksperimentell modell i flere tiår. Imidlertid mangler 3D-cellearrangement, romlige begrensninger på nevrittutvekst og realistisk synaptisk tilkobling. Sistnevnte begrenser studiet av struktur og funksjon i sammenheng med compartmentalization og reduserer betydningen av kulturer i nevrovitenskap. Tilnærming ex vivo det strukturerte anatomiske arrangementet av synaptisk tilkobling er ikke trivielt, til tross for at det er nøkkelen til fremveksten av rytmer, synaptisk plastisitet og til slutt hjernens patofysiologi. Her brukes to-foton polymerisasjon (2PP) som en 3D-utskriftsteknikk, noe som muliggjør rask fremstilling av polymere cellekulturanordninger ved bruk av polydimetylsiloksan (PDMS) på mikrometerskala. Sammenlignet med konvensjonelle replikastøpeteknikker basert på mikrofotolitografi, muliggjør 2PP-mikroskalautskrift rask og rimelig behandling av prototyper. Denne protokollen illustrerer design og fabrikasjon av PDMS-baserte mikrofluidiske enheter rettet mot dyrking av modulære nevrale nettverk. Som et prinsippbevis presenteres en tokammerenhet for å fysisk begrense tilkoblingen. Spesielt favoriseres en asymmetrisk aksonal utvekst under ex vivo-utvikling og får lov til å bli rettet fra det ene kammeret til det andre. For å undersøke de funksjonelle konsekvensene av ensrettede synaptiske interaksjoner, velges kommersielle mikroelektrodearrayer for å overvåke den bioelektriske aktiviteten til sammenkoblede nevronmoduler. Her illustreres metoder for å 1) fremstille former med mikrometerpresisjon og 2) utføre in vitro multisite ekstracellulære opptak i rottekortikale nevronkulturer. Ved å redusere kostnader og fremtidig utbredt tilgjengelighet av 2PP 3D-utskrift, vil denne metoden bli mer og mer relevant på tvers av forskningslaboratorier over hele verden. Spesielt innen nevroteknologi og nevrale dataopptak med høy gjennomstrømning, vil enkelheten og hurtigheten av prototyping forenklet in vitro-modeller forbedre eksperimentell kontroll og teoretisk forståelse av in vivo storskala nevrale systemer.
Introduction
Å undersøke nevronaktivitet i atferdsorganismer byr på flere utfordringer. For eksempel er fysisk tilgang til hjernevevet begrenset av behovet for å opprettholde sin integritet, slik at hjernens overfladiske regioner lettere vurderes. Å isolere spesifikke mål i det intakte vevet er ofte en skremmende oppgave og noen ganger umulig. Selv om dissosierte homogene nevronkulturer gir praktisk tilgang til molekylære, biokjemiske og biofysiske egenskaper til individuelle (sub) cellulære komponenter i en nevral krets, går en realistisk tilkobling og anatomisk organisering av den intakte hjernen tapt. Disse grunnleggende begrensningene inspirerte forskningsinnsatsen for å oppnå en middelvei, hvor in vivo kompleksitet unngås mens strukturen kan konstrueres in vitro, som er på forespørsel 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Spesielt har modulære nevronkulturer vært gjenstand for omfattende forskning de siste tiårene, med sikte på å takle viktige spørsmål om hjernefysiologi som beskrevet nedenfor.
Organisering: In vivo studier viser at hjernen er strukturert anatomisk i lag med presise celletyper og matriser av projeksjoner. Funksjonelle analyser avslørte organiseringen av nevrale nettverk i nodesamlinger og moduler, med presise tilkoblingsskjemaer10,11. Rollen til tilkobling og mikrokretsmotiver kan imidlertid ikke studeres tilstrekkelig in vivo på grunn av det store antallet synapser som er involvert, samt de sammenvevde effektene av utvikling og aktivitetsavhengig plastisitet.
Signaloverføring: In vivo eller tilfeldige in vitro-kulturer er det utfordrende å vurdere signaloverføring. Undersøkelse av aksonal ledning og aksjonspotensial langs lengden krever veiledende nevrittutvekst ved overflatefunksjonalisering eller kjemisk mønster, noe som gir et høyt signal-støy-forhold i ekstracellulære avlesninger av elektrisk aktivitet12.
Translasjonell relevans: Dekryptering av den eksklusive rollen til pre- versus postsynaptiske elementer på tvers av patologiske forhold krever å ha tilgang til disse elementene individuelt. Modulære kulturer med begrenset tilkobling, som effektivt skiller de pre- og postsynaptiske elementene, er uunnværlige verktøy for dette formålet13.
Det finnes flere metoder for å oppnå en form for struktur i nevronkultur. De kan grovt kategoriseres som kjemisk og fysisk overflatemanipulasjon9. De tidligere metodene 14,15 er avhengige av tilbøyeligheten til nevronceller til å feste seg til visse (bio)kjemiske forbindelser. Dette krever deponering av lim eller attraktive molekyler på en overflate med mikroskala presisjon og etter et detaljert mønster. Selv om dette tillater en delvis dekning av overflaten av cellene, etter ønsket mønster, er kjemiske metoder iboende begrenset og har en relativt lav suksessrate i nevrittvekstveiledning16. Full kontroll over aksondireksjonalitet krever etablering av en romlig gradient av ad-hoc-kjemikalier for å forme aksonal veiledning17. Sistnevnte metoder involverer fysisk overflatemanipulering og brukes oftere til å strukturere nevrale nettverk in vitro. Nevrale celler er fysisk begrenset på ønskede steder av geometriske begrensninger, for eksempel mikroskopiske kamre, vegger, kanaler, etc., og former en biokompatibel polymer som polydimetylsiloksan (PDMS) 3,5,6,7,18,19,20 herdet og størknet til en mikrofluidisk enhet. De facto-metoden for PDMS-mikrofluidisk fabrikasjon er myk fotolitografi21, hvor en todimensjonal maske er mønstret i mikroskala og ansatt for selektivt å etse et silisiumbasert materiale ved UV-eksponering. I et nøtteskall er en UV-herdbar harpiks (dvs. fotoresist) belagt på en silisiumskive gjennom spinnbelegg, og når en bestemt høyde bestemt av viskositeten og spinnhastigheten. Deretter plasseres den mønstrede masken over fotoresisten og utsettes for UV-lys. Transparente områder i masken, tilsvarende interesseområder, vil la UV-lys indusere lokalisert tverrbinding av fotoresistmolekylene. Områdene med ueksponert fotoresist vaskes bort ved hjelp av et løsningsmiddel, noe som resulterer i dannelsen av en hovedform. Dette brukes gjentatte ganger til å bake en valgfri elastomer (dvs. PDMS), som deretter graveres med ønsket geometri i så mange replikaer som ønsket. En slik produksjonsmetode er den vanligste metoden for å fremstille mikrofluidiske enheter22. Kanskje de viktigste begrensningene i myk fotolitografi er forutsetningen for bemerkelsesverdige kapitalinvesteringer og ukjentheten til biologiske laboratorier med de nødvendige teknikkene og kompetansen. Utarbeidelsen av masken og trinnene i myk fotolitografi som kreves for å designe komplekse geometrier med høyt sideforhold i flere høyder, er ikke-trivielle23 og krever ofte outsourcing. Selv om alternative og lavbudsjettsmetoder har blitt foreslått, tilfredsstiller de ikke alltid de høye presisjonskravene til biologisk prototyping24.
Her presenteres en alternativ produksjonsmetode, avhengig av to-foton polymerisasjon (2PP) og additiv produksjon. Det er enkelt og krever ikke i seg selv avansert mikrofabrikasjons- og mikrofotolitografikompetanse. Forskningsfeltet 2PP mikroproduksjon dukket opp på slutten av 90-tallet25, og siden da har det vært vitne til eksponentiell vekst26. Mer om de grunnleggende prinsippene i denne teknikken finner du andre steder26. Kort sagt, ved å fokusere eksitasjonslysimpulsen i tredimensjonalt rom, utnytter 2PP den ikke-lineære avhengigheten av multifotonabsorpsjon på intensitet. Dette gir mulighet for begrenset absorpsjon, noe som sikrer presis og selektiv eksitasjon innenfor svært lokaliserte regioner. I hovedsak blir en negativtonefotoresist, et materiale med nedsatt løselighet ved lyseksponering, utsatt for en fokusert stråle av femtosekund laserpulser ved en lav driftssyklus27. Dette muliggjør impulser med høye intensiteter ved lave gjennomsnittlige effekter, noe som muliggjør polymerisering uten å skade materialet. Samspillet mellom fotoinduserte radikale monomerer gir opphav til radikale oligomerer, initierende polymerisasjon som strekker seg gjennom fotoresisten opp til et distinkt volum, dvs. voxel, hvis størrelse avhenger av intensiteten og varigheten av laserpulser28.
I dette arbeidet presenteres to komponenter: A) design og rask fabrikasjon av en 3D-trykt form, gjenbrukbar mange ganger for å produsere engangspolymere nevroncellekulturenheter (figur 1), og B) deres mekaniske kobling på overflaten av plane nevroncellekultursubstrater, eller til og med av substratintegrerte mikroelektrodearrayer som er i stand til multisiteopptak av bioelektriske signaler.
Computer Assisted Design av en 3D mekanisk modell er veldig kort beskrevet her og ledsaget av trinnene som fører til en 3D-trykt mold og fabrikere PDMS-enheter er også detaljert.
En rekke dataassisterte designprogrammer kan brukes til å generere den startende 3D-objektmodellen og produsere en STL-fil for å kontrollere 2PP-utskriftsprosessen. I materialfortegnelsen er den første og den siste søknaden som er oppført, gratis eller utstyrt med en gratis lisens. Å konstruere en 3D-modell krever alltid å lage en 2D-skisse, som deretter ekstruderes i påfølgende modelleringstrinn. For å demonstrere dette konseptet er en generisk 3D CAD-programvaredesignprosess uthevet i protokolldelen, noe som fører til en struktur laget av overlappende kuber. For mer omfattende informasjon er en rekke elektroniske opplæringsprogrammer og gratis opplæringsressurser tilgjengelige, som angitt i materialfortegnelsen.
Den resulterende STL-filen blir deretter oversatt til en serie kommandoer som skal utføres av 3D-skriveren (dvs. kutteprosedyre). For den spesifikke 2PP 3D-skriveren som brukes, brukes programvaren DeScribe til å importere STL-filen og konvertere den til det proprietære General Writing Language (GWL) -formatet. Suksessen til 2PP-utskriftsprosessen er avhengig av forskjellige parametere, spesielt laserkraft og skannehastighet, søm og klekke-kutteavstander. Valget av disse parametrene, sammen med valg av objektiv og fotoresist, avhenger av designens minste funksjoner, samt den tiltenkte applikasjonen. Dermed blir parameteroptimalisering avgjørende for å oppfylle kravene til forskjellige designscenarier og brukstilfeller. For dette arbeidet har den anbefalte oppskriften IP-S 25x ITO Shell (3D MF) blitt vurdert som en konfigurasjon for utskriftsparametrene. Til syvende og sist skrives en mekanisk stabil trykt del ut med den nødvendige oppløsningen samtidig som 3D-utskriftstiden minimeres.
Formdesignet og tilhørende STL-fil, demonstrert i dette arbeidet, består av en firkantet ramme for å skille rommet til en cellekultur i to rom: et ytre område (dvs. referert til som kilde senere) og et indre område (dvs. referert til som Target senere). Disse to rommene er forbundet gjennom sett med mikrokanaler, hver preget av skarpvinklede grenser, designet for å spesifikt hindre veksten av nevritter fra målet til kilden, men ikke omvendt, og som sådan fremme en retningsbestemt synaptisk forbindelse mellom nevroner som vokser på de to områdene.
Tidligere studier benyttet forskjellige geometrier av mikrokanaler for å oppmuntre til retningsbestemt vekst av nevritter. Eksempler er trekantede former18, kanalpiggstrukturer19 og avsmalnende kanaler20. Her benyttes et design med skarpe vinkelbarrierer over mikrokanalens grenser, også preget av asymmetriske innganger. Disse mikrokanalene tjener til å etablere kontinuitet mellom et lukket interiør, målrommet og det ytre området, kilderommet. Traktformen til den første delen av mikrokanalene, fra kildesiden, er utformet for å fremme dannelsen av aksonale bunter og deres vekst langs den korteste, dvs. rette linjen, banen som forbinder kilden til målet. Det trekantede rommet som realiseres ved å vende mot skarpe vinkler, har større volum på målsiden for å sikte på effektivt å forsinke nevrittenes veifinning, samtidig som det favoriserer rask skyting av bunter som stammer fra kilden og okkupasjonen av den tilgjengelige plassen. Valget av 540 μm for lengden på mikrokanalene filtrerer effektivt ut den generelt kortere dendrittiske utveksten39. I tillegg forhindrer deres høyde på 5 μm cellesomata i å trenge gjennom mikrokanalene. Samlet sett viste denne konfigurasjonen seg å fremme ensrettet tilkobling mellom de ytre, kilde- og indre målmodulene, og den presenteres her som et prinsippbevis blant de mange alternative valgene.
Mens PDMS-enhetene, fremstilt av 2PP-formen, kan festes til overflaten av vanlige cellekultursubstrater, for eksempel glassdeksler eller petriskåler, ble det i dette arbeidet brukt kommersielt tilgjengelige substratintegrerte mikroelektrodearrayer. Ingen innsats har blitt gjort for å optimalisere 3D-designet til mikroelektrodeoppsettet, og den mekaniske koblingen ble utført under stereomikroskopiveiledning som bare tok sikte på å plassere enheten over matrisen, slik at noen mikroelektrode ble avdekket i begge sider, kilden og målet. Dette muliggjør en foreløpig vurdering av de funksjonelle konsekvensene av den begrensede tilkoblingen i nevroncellekulturer.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyrehåndtering ble utført i samsvar med europeisk og italiensk lovgivning (Europaparlaments- og rådsdirektiv av 22. september 2010 [2010/63/EU]; Det italienske regjeringsdekretet av 4. mars 2014, nr. 26), ble eksplisitt godkjent av den institusjonelle OpBA (Committee for Animal Care) ved Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati og ble offisielt godkjent av det italienske helsedepartementet (Auth. No. 22DAB. N.UVD). Disse førte til tilgjengeligheten av ikke-sansende materiale fra det eksplanterte hjernevevet fra rotter, som skulle brukes til eksperimentell validering av metoden presentert i dette arbeidet.
1. 3D formfremstilling ved to-foton polymerisering
- Generere CAD-filene
MERK: Følgende trinn viser en generisk 3D-designarbeidsflyt, ved hjelp av dataassistert designprogramvare (dvs. SolidWorks). Eksempelet på STL-designfilen som er beskrevet i dette arbeidet (figur 2), er tilgjengelig som tilleggskodefil 1, samt gjennom Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).- Start skrivebordsprogrammet for datamaskinstøttet designprogramvare. Fra den øverste menylinjen velger du Ny.
- Velg Del: En 3D-representasjon av én enkelt utformingskomponent blant alternativene. Trykk på tastekombinasjonen Ctrl + 5 for å etablere toppvisningen av skissen.
- Velg Skisse fra sidepanelet, og velg Hjørnerektangel. Velg en kant av rektangelet ved å klikke på det. Når et parameterpanel vises, angir du lengden til 100 enheter.
- Gjenta trinn 1.1.3 for kanten vinkelrett på den forrige: sett lengden til 50 enheter. Velg rektangelet ved å dra over det mens du holder venstre museknapp.
- Fra Legg til relasjon-menyen velger du Reparer for å begrense relasjonene mellom linjer.
- Gå ut av skissen og gjenta trinn 1.1.3 til 1.1.5, og opprett et nytt (mindre) rektangel, som overlapper forrige skisse.
- Velg Funksjoner fra sidepanelet, og velg Ekstrudert boss/base: sett dybden på både de store og små rektanglene til henholdsvis 5 og 10 enheter.
- Fra Fil-menyen lagrer du delen i STL-format (dvs. Standard flisleggingsspråk).
- Behandle CAD-filene
- Overfør STL-filen til en personlig datamaskin, utstyrt med DeScribe-applikasjonsprogramvaren.
- Start Beskriv og åpne STL-filen fra Fil-menyen. En 3D-representasjon av modellen vises.
- Fra orienteringsdelen på menyen til høyre roterer du modellen for å orientere den riktig i rommet, og sentrerer den i planet.
- Juster den generelle skaleringen ved å velge Skalering-delen på menyen til høyre.
- Fra rullegardinmenyen øverst velger du oppskriften på IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Dette spesifiserer IP-S som fotoresist, 25x for forstørrelseskraften til objektivet, Indium Tin Oxide (ITO) belagt substrat som utskriftssubstrat og skall- og stillasutskrift som driftsmodus med mellomstore funksjoner (MF).
- Naviger gjennom veiviseren, velg og still inn kutteavstand til 1 μm og lukeavstand til 0,5 μm for både skallet og stillaset.
- I utdatatrinnet i importveiviseren, under splitting, definerer du blokkstørrelsen som X = 200 μm, Y = 200 μm og Z = 265 μm og blokkforskyvningen som X = 133 μm, Y = 133 μm og Z = 0, slik at de delikate strukturene til mikrokanalene ikke påvirkes av sømlinjene.
- Som skannemodus bruker du standard: Galvo for X-Y-planet og Piezo for Z-aksen.
- Trykk på Lagre , og erstatt linjen var $baseLaserPower = $shellLaserPower med var $baseLaserPower = 75 på den neste tekstmenyen, for å redusere lasereffekten i det laveste laget av utskriften til 75 %.
- Overfør GWL-filene oppnådd ved trinnene ovenfor til arbeidsstasjonen dedikert til 2PP 3D-utskrift.
- 3D-utskrift og prøveutvikling
- Start NanoWrite-applikasjonsprogramvaren . Etter at skriveren er initialisert, klikker du på Exchange Holder på programvaregrensesnittet for å sette inn underlagsholderen og montere målet.
- Monter 25x-objektivet i riktig posisjon på nesestykket. Identifiser hvilken side av glasssubstratet som er belagt med ITO, med et elektronisk multimetersett for å måle motstander: avlesningen skal være lave verdier, for eksempel 100-300 Ω, men bare for den ITO-belagte siden.
- Plasser glassunderlaget på holderen, og orienter den ITO-belagte siden oppover. Bruk tape for å holde den godt på plass.
- Under den kjemiske avtrekkshetten, påfør en dråpe IP-S fotoresist i midten av glasssubstratet.
- Sett holderen inn i 3D-printeren, med harpiksdråpen vendt mot målet (dvs. nedover).
- Gjennom programvarefilmenyen laster du inn GWL-filene. Velg Eksempel på tilnærming for å flytte objektivet nær harpiksfallet.
- Velg Finn grensesnitt for å tillate deteksjon av ITO-fotoresist-utskriftsgrensesnittet, basert på brytningsindeksforskjellen mellom de to materialene.
- Velg Start jobb for å starte utskriften. Når utskriften er ferdig, trykker du Exchange Holder for å hente holderen.
- Ta tak i holderen og fjern underlaget forsiktig med den trykte delen. Senk glasssubstratet ned i propylenglykolmetyleter (PGMEA) i 20 minutter under avtrekkshetten for å utvikle den trykte delen.
- Fjern underlaget fra PGMEA og senk det i isopropanol i 5 minutter. La den trykte delen lufttørke under den kjemiske avtrekkshetten.
- Behandling etter trykk og montering av former
- Herd den trykte delen ved eksponering for UV-lys (dvs. 365-405 nm) med tilstrekkelig effekt i 5-20 minutter (se Diskusjon for strømdetaljer).
- Fjern den trykte delen forsiktig fra glassunderlaget under en avtrekkshette for laminær luftstrøm. Slipp ~2 μL harpiks til bunnen av en 35 mm x 10 mm petriskål.
- Plasser den trykte delen forsiktig over dråpen og la harpiksen strømme under delen. Herd den trykte delen ytterligere ved eksponering for UV-lys, i 5 minutter.
- Dekk petriskålen med korken og overfør den til ovnen for varmeherding, over 30 min ved 80 °C. Ikke forvarm ovnen for å unngå deformasjon eller brudd på den trykte delen. Etter herding blir den trykte delen permanent festet til bunnen av petriskålen. Fra nå av vil den trykte og monterte delen bli referert til som mold.
2. PDMS-enhetsfabrikasjon fra form- og cellekultursubstratene
- Fabrikasjon av PDMS-enheter
- Forbered 20 ml 10: 1 (vektforhold) blanding av basen ogherdemidlet av upolymeriserte PDMS. For hver enhet, og avhengig av ønsket høyde, er 1-2 ml PDMS-blanding nok. Oppbevar overflødig upolymerisert PDMS ved -20 °C for senere bruk.
- Under en hette med laminær strømning røres blandingen grundig i 4 minutter. Når blandingen fanger luftbobler jevnt, blir den ugjennomsiktig.
- Overfør blandingen til et 50 μL μrør og sentrifuge det ved 168 x g i 5 minutter, for å eliminere luftbobler fra blandingen og oppnå et klart utseende.
- Behandle formen med 10 μL hydrofobemiddel (dvs. Repel-silan ES) og la den hvile i 7 minutter, og sørg for en jevn løsrivelse av polymeriserte PDMS fra formen senere.
- Skyll mugg 1x med 70% etanol og 2x med avionisert (DI) vann. La formen lufttørke under den laminære strømningshetten.
- Hell PDMS-blandingen forsiktig på formen, til den tiltenkte endelige høyden på enheten er nådd. For å forhindre dannelse av luftbobler, hell blandingen forsiktig og fra nær avstand til formens overflate.
- Dekk formen og overfør den i 18 min til en ovn som er forvarmet og stabilisert ved 80 °C, for herding. For enhetshøyder over 5 mm og opptil 1 cm, forleng herdetiden fra 18 til 25 minutter.
- Under den laminære strømningshetten, løsne forsiktig den herdede PDMS-blokken fra formen og senk den i isopropanol i minst 10 minutter, inne i et glass petriskål. Isopropanol eliminerer ukryssbundet PDMS. Hold alltid PDMS-blokken dekket.
- Forny isopropanolen og, under et stereomikroskop, kutt forsiktig ut den sentrale firkantede delen av enheten (identifisert som målområdet, i dette arbeidet) med en oftalmisk stikkkniv. Fortsett deretter med å kutte ytterligere langs kantene for å oppnå enhetens ultimate form.
- Hent enheten fra isopropanol og senk den i etanol i 30 minutter, og skyll den deretter 3x med sterilt DI-vann. Oppretthold steriliteten fra dette punktet og fremover.
- Under en hette med laminær flyt overfører du enheten til en ny petriskål, og lar hetten stå litt åpen. La det lufttørke helt.
- Enhetsmontering og klargjøring av cellekultursubstrater.
- Steriliser hver mikroelektrode arrays (MEAs) ved å senke i 70% etanol i 30 minutter, og skyll den deretter 3x med sterilt DI-vann.
- Ved hjelp av steril fin pinsett, under en laminær hette og stereomikroskop, monter PDMS-enheten på det indre området av en MEA. Juster den ene siden av PDMS-enheten til midten av det indre MEA-området, med substratintegrerte mikroelektroder, slik at få mikroelektroder blir avdekket fra både kilde- og målområder (se figur 2).
MERK: For dette arbeidet er det ikke nødvendig å justere MEA-mikroelektroder til PDMS-enhetens mikrokanal. Et forsiktig trykk på enheten kan være nødvendig for å oppnå en tett forsegling mellom PDMS-enheten og MEA-overflaten. Unngå for enhver pris å berøre mikroelektrodene med pinsettspissen. - Sett MEA med PDMS-enheten inn i plasmarensekammeret for å aktivere overflateaktiveringen gjennom luftplasma. Begynn prosessen med en 4 min vakuumpumpe evakuering av kammeret. Deretter åpner du luftventilen litt for å tillate kontrollert luftblødning. Lukk luftventilen og slå på plasmainduktorene, og juster RF-effektnivået mellom 10 W og 18 W.
- Når et glødende lys vises, la prosessen løpe i 80 s. Slå deretter av plasmainduktoren, lukk vakuumpumpeventilen og åpne luftventilen forsiktig. Åpne kammeret for å hente MEA.
MERK: Hvis plasmabehandlingen innebærer å utsette MEA for et ikke-sterilt miljø, plasser hver MEA under UV-lys i en laminær strømningshette i 30 minutter for å sikre steriliteten. - Tilsett 1 ml polyetylenimin (PEI) 0,1 % vekt/vol oppløsning til MEA og inkuber den ved 37 °C over natten. Aspirer PEI-oppløsningen og skyll med sterilt DI-vann 5x. Tilsett 1 ml av cellekulturmediet til MEA og inkuber det før cellesåing.
3. Neuronal cellekultur og elektrofysiologi
- Forbered på forhånd disseksjonsmediet, fordøyelsesløsningen og løsningene 1-3 (se tabell 1).
- Dissociert neuronal cellekultur.
- Ta forsiktig tak i en nyfødt Wistar-rottevalp i alderen 0-1 dager ved snuten og utfør rask halshugging ved hjelp av en skarp saks.
- Skal av hodebunnshuden, gjør et snitt langs den sagittale midtlinjen av skallen ved hjelp av fin saks, og lag deretter et koronal kutt gjennom skallen ved krysset av cerebellum.
- Fjern skallen, øs ut hjernen med en fin slikkepott og overfør den til kaldt (4 °C) disseksjonsmedium.
- Fjern det subkortikale vevet, hippocampus og hjernehinnene. Hakk vevet i små biter (dvs. 1-2 mm3) og overfør dem i et 15 ml rør. Kast oppløsningen og skyll vevet med friskt disseksjonsmedium, etterfulgt av en vask med fordøyelsesmedium.
- Kast fordøyelsesmediet, og tilsett deretter 1 ml oppløsning 1. Inkuber blandingen ved 37 °C i 5 minutter. Kast oppløsning 1 og skyll vevet med nytt disseksjonsmedium. Tilsett deretter 1 ml oppløsning 2 og hold blandingen i 10 minutter ved 4 °C.
- Kast oppløsning 2 og skyll vevet med nytt disseksjonsmedium. Deretter tilsettes 1 ml oppløsning 3. Dissosiere cellene mekanisk ved å pipettere sakte opp og ned løsningen 20 til 30 ganger. Som en jevn uklar blanding av dissocierte celler vises, øk volumet til 3 ml ved å tilsette disseksjonsmedium.
- Samle cellepelleten ved å sentrifugere blandingen ved 100 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml forvarmet kulturmedium.
- Telle celler (dvs. ved et celletellingskammer) og juster tettheten til cellesåløsningen tilsvarende.
- Frø hver MEA med 1 ml såoppløsning med den nominelle celletettheten på 1,8 x 106 (~ 6500 celler / mm2). Inkuber de frøede MEAene i en fuktig inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Bytt ut mediet med ferskt (dvs. ukentlig laget) kulturmedium hver 2.
- Ekstracellulær elektrofysiologi
MERK: Dissosierte nevroncellekulturer når en fullt moden elektrisk fenotype etter 2-3 uker in vitro. Følgende avsnitt beskriver en ekstracellulær stimuleringsprotokoll ved hjelp av en kommersiell MEA-applikasjonsprogramvare (Experimenter) for elektrisk å stimulere en av nevronpopulasjonene dyrket i moduler, dvs. kilde eller mål, samtidig som aktiviteten til begge populasjonene registreres, i modne nettverk.- Monter forsiktig en MEA inne i hovedscenen til flerkanals elektronisk forsterker, inne i en tørr inkubator (37 °C, 5% CO2) og la den romme i 10 minutter. En tilpasset PDMS-hette kan fremstilles separat og brukes som et tett deksel for hver MEA, for å redusere vannfordampning og opprettholde sterilitet.
- Start Experimenter-programvaren. Sett samplingsfrekvensen til 25 kHz og start datainnsamlingen ved å trykke på Start DAQ. I dataskjermpanelet vises råspor av ekstracellulært registrert aktivitet for hver kanal.
- Overvåk den spontane aktiviteten og identifiser og velg visuelt 3 par nærliggende mikroelektroder som er aktive under utbrudd av nettverksomfattende spontane synkroniserte aktivitetsutbrudd, enten fra kilde- eller målsidemikroelektroder.
- I stimulatorpanelet i programvaren konfigurerer du parametrene for hvert av de stimulerende mikroelektrodeparene i bipolar konfigurasjon: velg en bifasisk pulsbølgeform og sett toppamplitudene til ± 800 mV, og pulsvarigheten til 200 μs.
- Sett opptakeren og ta opp i en periode på 300 ms før til 1000 ms etter stimuleringen.
- Gjenta trinn 3.3.3 til 3.3.5 for kilde- og målsiden på en sammenflettet måte for det nødvendige antall repetisjoner.
Representative Results
Fabrikasjonen av en 2-roms polymer (neuronal) cellekulturenhet er rapportert her, som eksemplifiserer bruken av 2PP 3D-utskrift for rask prototyping av PDMS-enheter. Spesielt produseres en enhet for modulære nevrale nettverk med ensrettet synaptisk tilkobling, og dens funksjonelle karakterisering presenteres når det gjelder ekstracellulær elektrofysiologi fra flere steder. Kort fortalt ble en mikrometerskala form realisert ved hjelp av direkte laserskriving, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig 3D-skriver. Spesielt leverer skriveren en effekt på 50 mW gjennom laserpulser med senterbølgelengde på 780 nm og en varighet på 80 til 100 fs. Under fabrikasjonsprosessen fokuseres laserstrålen gjennom skriverens objektive (25x, NA = 0,8) på negativtonefotoresisten (IP-S) for å skanne utskriftsvolumet ved hjelp av galvo-skanneren for x- og y-aksene, og piezotrinnet for z-aksen. Utskriftsvolumet ble passende delt i blokker på 200 mm x 200 mm x 265 mm for å realisere en form med total størrelse på 6500 mm x 6500 mm x 545 mm og nominelt volum på 12.423 ml. Figur 2A representerer en 2D-skisse av formen, som fremhever dens dimensjoner og funksjoners størrelse, mens figur 2B viser et nærbilde av den ferdige enheten montert på en MEA. Formene som ble utarbeidet som beskrevet i forrige avsnitt var holdbare og kunne gjenbrukes mer enn 50 ganger for å fremstille PDMS-enheter.
Den trykte formen ble brukt til støping av PDMS-enheten, som deretter ble montert på det indre området av glasssubstratintegrerte arrays av mikroelektrodearrayer (MEA), som skal brukes til ekstracellulære opptak av nevronal elektrisk aktivitet og som et prinsippbevis. Kommersielle substratintegrerte MEAer ble brukt til å overvåke aktiviteten til modulære kulturer som respons på romlig lokaliserte elektriske stimuli levert ekstracellulært av en delmengde av mikroelecrode lokalisert i hvert kulturrom. Hver MEA inneholder 120 mikroelektroder av titannitrat (TiN) med en diameter på 30 μm og 100 μm interelektrodestigning. Figur 2C-D viser plasseringen av PDMS-enheten på toppen av MEA. De geometriske egenskapene til individuelle mikrokanaler av enheten sammen med det totale fotavtrykket til kammeret vist i figur 2C, fører til en compartmentalization av de dyrkede nevronene. Disse kan skilles ut fra rommet de tilhører, i det ytre området (Kilde) på enheten, eller i det indre området (Target) på enheten. Den foretrukne aksonale veiledningen, begrenset fra kilden til målet, dikteres av mikrokanalenes skarpvinklede kanter. Figur 2D viser plasseringen av den polymere enheten på MEA og det relative dekningsområdet for opptakselektroder plassert i kilde- eller målrommene. Merk at en presis justering av innsiden av enhetens mikrokanaler til en eller flere rader med MEA-mikroelektroder ikke var nødvendig for vår case-studie eller forfulgt.
Representativt bevis for asymmetrisk nevrittvekst er gitt i figur 3, under ex vivo-utvikling, som viser fluorescerende merkede nevritter i levende bildebehandling, 6 dager (figur 3A) og 2 dager etter cellebelegg (figur 3B-D). Mens nevrittene på målsiden av enheten møtte skarpe vinkelbarrierer som hindringer som hindret deres fremgang gjennom rommet, vokste nevrittene som stammer fra kildesiden uavbrutt og krysset kanalene. Denne asymmetrien favoriserer en ensrettet aksonal forbindelse mellom nevroner i de to rommene, som projiserer fra kilde til mål, som eksplisitt ment fra designet. Dette resultatet støttes videre av en (funksjonell) elektrofysiologisk evaluering av elektriske responser fremkalt av stimuli alternativt levert i hvert av de to rommene.
Etter 3-4 uker in vitro, da nevrale nettverk nådde full modenhet29,30, kunne den funksjonelle tilkoblingen over de to rommene undersøkes ved å levere korte elektriske stimuli og overvåke nevronresponsene de fremkalte31. Bifasiske elektriske impulser med en amplitude på 800 mV ble deretter påført alternativt bare til kilden eller bare til målpopulasjonene (N repetisjoner = 150, N modulære kulturer = 6), levert av 3 sidestilte par plane mikroelektroder i en bipolar konfigurasjon, og på en sammenflettet måte. Derfor kan de 3 elektrodeparene være plassert innenfor kildeområdet til MEA eller innenfor målområdet til MEA. De elektriske responsene fremkalt av hver stimulus kunne deretter detekteres av alle MEA-mikroelektroder etter en forplantningsforsinkelse. Opptakene ble utført med en samplingsfrekvens på 25 kHz / kanal, og de resulterende ekstracellulære rå elektriske signalene ble digitalisert ved en analog-til-digital konverteringsoppløsning på 16 bits. En terskelkryssende toppdeteksjonsalgoritme32 ble brukt offline for å oppdage tidspunktet for forekomster av ekstracellulære aksjonspotensialer, uten å utføre piggsortering. Figur 4A-B avslører tydelig en sterk asymmetri av fremkalte responser, gjentatt 150 ganger, avhengig av plasseringen av stimulusleveransen, noe som tyder på en signifikant funksjonell innvirkning av de geometriske begrensningene på den foretrukne retningen for tilkobling. Faktisk, ved stimulering av kildesiden, økte avfyringshastigheten til kildenevronpopulasjonen - estimert ved å beregne histogrammet peri-stimulus spike-times - som forventet og genererte et fullstendig nettverksutbrudd av handlingspotensialer 33,31,34 og det ble fulgt, etter en forsinkelse, av en økning i avfyringshastigheten til målpopulasjonen. Imidlertid, da stimuleringen ble levert innen målpopulasjonen, økte bare avfyringsraten til målpopulasjonen, og kildepopulasjonen forble for det meste stille. Figur 4C-D gjentar det samme stimulus / responsparadigmet i en kontrollkultur, uten polymer enhet tilstede (dvs. en ustrukturert nevronkultur), ble de ekstracellulære stimuli også levert over 4 repetisjoner. For slike kontrollbetingelser oppstod ingen asymmetri i responsene fremkalt av noen av stimulusene. Mens delmengden av MEA-mikroelektroder som ble brukt til å levere stimuliene, samsvarte med den som ble brukt i modulære nettverk, førte plasseringen av stimulusleveransen til en lignende fremkalt respons fra hele befolkningen. Dette bekrefter at PDMS-enheten favoriserte ensrettet synaptisk tilkobling, på tvers av de to rommene. Samlet sett indikerer asymmetriske responser fremkalt i modulære kulturer (N = 6) og symmetriske responser fremkalt i kontrollkulturer (N = 4) sterkt en begrenset anatomisk tilkobling av et kompartmentalisert in vitro-system. De elektrofysiologiske dataene og skriptene som brukes til å generere figur 4, gjøres tilgjengelig gjennom Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).
Figur 1: Skisse av 2PP mikro-mold produksjon og PDMS kopi molding. (A) En 3D-modell er designet i CAD og eksportert i Standard Tessellation Language (STL) formatfil, (B) instruerer sin 2-foton 3D-utskrift gjennom laserindusert polymerisering i en dråpe harpiks (IP-S). (C) Den resulterende strukturen brukes som en form for gjentatt fabrikasjon av PDMS-kopier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på intern rask prototyping av en polymer (nevron) cellekultur PDMS-enhet. (A) På mindre enn 24 timer gjør mikroskala additiv produksjon det mulig å gå fra en CAD-modell til en 3D-trykt master, som skal brukes umiddelbart og gjentatte ganger som en replikaform med biokompatible elastomerer, for eksempel PDMS. (B-C) De resulterende PDMS-enhetene er koblet til et nevroncellekulturplant substrat, her representert av en rekke mikroelektroder. For den spesifikke prøveutformingen i (A) er to kamre definert: ett referert til som Kilde og indikert med S, og det andre referert til som Target og indikert med T. (D) Nevroner belagt i hvert kammer kan bare vokse sine nevritter gjennom en serie mikrokanaler. Når det justeres hensiktsmessig under stereomikroskopiveiledning i (C), blir to sett med substratintegrerte mikroelektroder eksponert, slik at den bioelektriske aktiviteten til nærliggende nevroner i begge rom kan stimuleres og registreres. Merk her at justering av mikroelektroder innenfor individuelle mikrokanaler ikke var prioriteten til dette proof-of-principle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Levende avbildning av celleimpermente fluorescerende reportermolekyler, identifiserer nevritter forlenget av nevroner, få dager etter cellebelegg. (AD) Representative konfokale fluorescensmikrografer av modulære nevronkulturer av enheten fremstilt fra figur 1 og figur 2 (N = 4, 128 individuelle mikrokanaler) er ervervet 2 og 6 dager etter cellebelegg. (VG Nett) 40x forstørrelse og en omvendt gråskala av mikrografene for økt synlighet. Endingene av mikrokanalene fra kilde- og målrommene er betegnet med henholdsvis S og T. (A) viser det brede skannede bildet av kulturen, der kilden (dvs. det indre firkantede området) og målet (dvs. det ytre området) er fulle av celler, 6 dager etter plating. (B) og (C) viser, på det tidligere tidspunktet på 2 dager etter plating, veksten av nevritter ved henholdsvis kilden og målsiden av mikrokanalene. De små svarte trekantene indikerer representative eksempler på antatte aksonbunter som tilsynelatende bare stammer fra kilden. De pilformede mikrokanalenes grenser peker på forlengelsen av nevritter langs kanten (B), hvor deres passasje er uavbrutt og styrt mot målet. I motsatt retning, og ved siden av målendelsen av en mikrokanal (C), er nevritter som stammer fra målet og går videre til kildesiden fanget i de skarpe hjørnene. (D) avslører videre detaljene om nevrittutvekst inne i en mikrokanal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Funksjonell karakterisering av nevronale elektriske responser, med og uten PDMS-enhet. MEA ble brukt som celledyrkingssubstrater og brukt til å måle nettverksbrede spikingresponser fremkalt av en veldig kort (dvs. 200 μs, 0.8V) bifasisk elektrisk stimuleringspuls, levert i en bipolar konfigurasjon. Med PDMS-enheten i figur 2 varierer de neuronale spikingresponsene som er registrert fra kilden (rød) og fra målet (blå), avhengig av hvor stimulansen leveres. Antatte aksonale, synaptiske og integrasjonsforsinkelser blir tydelige i (A), men ikke i (B), noe som tyder på at en foretrukket synaptisk tilkobling (dvs. fra kilde til mål) eksisterer. (VG Nett) Under kontrollforhold (dvs. uten PDMS-enhet) er fremkalte responser oppdaget ved to forskjellige sett med MEA-mikroelektroder ikke avhengig av stimulusleveringsstedet. Den blekfargede skyggeleggingen, som omslutter linjene i plottene, betegner den øyeblikkelige standardfeilen til gjennomsnittet (N-stimuli = 150). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på løsning | Komposisjon | ||
| polyetylenimin (PEI) 0,1% | 1 ml PEI-stamoppløsning, 9 ml sterilt avionisert (DI) vann. | ||
| Dyrkningsmedium (50 ml) | Minimum essensielt medium (MEM), supplert med 20 μM glukose, 50 μg/ml gentamicin, 50 μM L-glutamin og 10 % varmeinaktivert hesteserum. | ||
| Disseksjonsmedium (1000 ml) | Hanks′ balanserte salter 9,52 g, natriumbikarbonat 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glukose 6 g, kynurensyre (endelig konsentrasjon 200 μM), D-AP5 (endelig konsentrasjon 25 μM), gentamicin 250 μl, bovint serumalbumin 300 mg, magnesiumsulfat 1,44 g. Juster pH til 7,3, beskytt mot lys og oppbevar ved 4 °C. | ||
| Fordøyelsesmiddel (100 ml) | Natriumklorid 800 mg, kaliumklorid 37 mg, di-natriumhydrogenfosfat 99 mg, HEPES 600 mg, natriumbikarbonat 35 mg, kynurensyre, 200 μL (fra 100 mM lager), D-AP5 100 μL (fra lager 25 mM). Juster pH til 7,4, beskytt mot lys og oppbevar ved 4 °C. | ||
| Løsning 1 | Trypsin 5 mg, Deoksyribonuklease I 1,5 mg, i 2 ml fordøyelsesmedium. | ||
| Løsning 2 | Trypsinhemmer 5 mg, i 5 ml disseksjonsmedium. | ||
| Løsning 3 | Deoksyribonuklease I 1,5 g, i 2,5 ml disseksjonsmedium. | ||
Tabell 1: Tabell over løsninger. Se materialfortegnelsen for produktbeskrivelser.
Supplerende kodefil 1: STL-utformingsfilen tilsvarer strukturen som er vist i figur 2A. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Til tross for at den er flere tiår gammel, er anvendelsen av 2PP-teknologi i mikrometerskala PDMS-basert replikastøping en nylig utvikling43,44. I denne sammenheng diskuteres en rekke punkter nedenfor for å hjelpe brukerne med å effektivt reprodusere dette arbeidet.
For 3D-modelldesign må du sørge for at modellen ikke har hull eller selvskjæringspunkter. Gi privilegier til det binære filformatet når du lagrer som STL, for det mindre filstørrelsesfotavtrykket enn ASCII-kodet. Dette er spesielt nyttig for design med intrikate geometrier og for milliliterbrede objekter. Bruk av binære STL-filer innebærer også lav CPU-belastning, senere i prosessen forbereder den mekaniske delen som skal 3D-printes. Funksjonenes fysiske dimensjoner i STL-filen er representert i dimensjonsløse enheter. Under etterbehandling av STL-filen tolkes enheter som mikrometer. Derfor anbefales det å ta i bruk interesseenheten på forhånd, dvs. mikrometer, når du forbereder filen. Nøyaktigheten til den trykte modellen bestemmes av antall overflater som tilnærmer seg tessellerte trekanter. For et utilstrekkelig antall overflater vil uønsket overflateruhet oppstå. Ikke desto mindre kommer sikte på for høy nøyaktighet av et veldig stort antall overflater til prisen av en høy beregningsbelastning, noe som fører til at filbehandlingen blir treg.
For 3D-utskrift, under utskrift, dannes det fysiske 3D-objektet ved hjelp av rask galvo-skanning i x-y-planet og piezobevegelse i z-retningen. Dette fokuserer femtosekund laserstrålen innenfor en gitt 3D voxel. Men når utskriftsstrukturer er større enn galvoens og piezoens romlige dekningsområder, må objektet programmatisk deles inn i blokker. Selv om dette er et krav for millimeterstore trykte deler, er kryss mellom blokker knyttet til (ufullkomne) sømlinjer. Nøye optimalisering av blokkantall og plassering av sømlinjer i x-, y- og z-retninger er avgjørende for å unngå å forstyrre kritiske geometriske trekk ved det endelige objektet med sømlinjer. Bobler kan dannes ved utskriftsgrensesnittet av ulike årsaker (f.eks. substrater fotoresistens urenheter og inhomogeniteter), og negativt påvirke kvaliteten og integriteten til den trykte strukturen. Videre kan høyere lasereffekt føre til en økning i forekomsten. Å redusere lasereffekten, på det laveste laget av den trykte delen, vil minimere sjansene for bobledannelse. Som et alternativ til å trykke hele delen som en solid struktur, kan skall- og stillasmetode vurderes. Det innebærer bare å skrive ut den ytre overflaten av delen (skallet), samt trekantede prismeelementer i den. Disse elementene er adskilt av horisontale lag (stillas), som holder den upolymeriserte harpiksen i små lommer. Denne metoden forkorter utskriftstiden betydelig, noe som er spesielt relevant for millimeterstore strukturer. Imidlertid, da ikke-polymerisert harpiks forblir, er UV-eksponering etter utskrift avgjørende for å sikre full mekanisk stabilitet, selv om dette trinnet må utføres forsiktig for å unngå deformasjon av den trykte delen. Tiden etter herding avhenger av hvilken harpiks du velger, delens tykkelse og UV-effekt40. For optimale resultater anbefales det å gjennomføre en innledende prøve for å estimere tiden som trengs for full dybdeherding, ved hjelp av en dråpe fotoresist og evaluering av snittsnittet etter UV-eksponering. Den vanlige herdeperioden varierer mellom 5 og 20 minutter.
For PDMS-replikastøping kan ren fabrikasjon av en PDMS-enhet med mikrometerskalafunksjoner, uten renromsfasiliteter, være utfordrende: luftbårne mikropartikler kan ligge på den svært klebende overflaten av PDMS og hindre forseglingen mellom enheten og substratet, eller blokkere delen av individuelle mikrokanaler. Utførelse av protokolltrinnene under en avtrekkshette for laminær luftstrøm og konsekvent skjerming av PDMS-overflaten med isopropanol minimerer risikoen for kontaminering betydelig. Herdetemperaturen og dens varighet påvirker direkte PDMS-tverrbindingen og de resulterende fysiske egenskapene. Spesielt er klebeevnen til herdet PDMS en kritisk faktor. På den ene siden er det nødvendig med en tett forsegling mellom PDMS-enheten og overflaten som brukes til nevroncelledyrking (f.eks. Et glassdeksel eller en MEA), for effektivt å begrense passasjen av nevrittene. På den annen side skal PDMS-enheten festes til overflaten reversibelt, slik at det delikate isolerende laget MEA ikke blir skadet etter at enheten er fjernet. Mens PDMS-krymping under herding oppstår og kan korrigeres ved forhåndsskalering av formen, vil krymping for temperaturer og herdeintervaller som er angitt her, være mindre enn 2%42 og vil ikke påvirke signifikant, enkeltlags PDMS-enheter. Totalt sett må du følge de anbefalte verdiene for herdetemperatur og varighet nøyaktig for de beste resultatene.
Oversikt over fordeler og begrensninger ved metoden
En teknikk basert på 2-foton direkte laserskriving foreslås for rask fabrikasjon av polymere enheter i mikroskala for eksperimentell studie av modulære nevrale nettverk. I motsetning til myk fotolitografi krever den foreslåtte tilnærmingen ikke et høyt nivå av teknisk ekspertise, forutsatt at et funksjonelt 2PP 3D-utskriftsoppsett er tilgjengelig og operativt. Bemerkelsesverdig nok gjør metoden det mulig å gå fra en CAD-designet 3D-modell til en funksjonell PDMS-enhet i løpet av en enkelt dag, og gir dermed en direkte og effektiv vei fra konsept til konkret realisering. Spesielt reduserer valg av skall-og-stillas-utskriftsmodus betydelig tiden som trengs for å lage formen, da bare en brøkdel av volumet skrives ut. Etterfølgende UV-herding av den trykte komponenten garanterer mekanisk stabilitet og robusthet, som verifisert her over 50 støpesykluser med PDMS.
Sammenlignet med tradisjonelle metoder har 2PP 3D-utskrift en klar fordel, noe som er mest uttalt når det gjelder fremstilling av former med et betydelig sideforhold, krevende oppløsningskrav og komplekse tredimensjonale geometrier. Produksjonen av masterformer ved bruk av standard UV-litografi er begrenset av en motstandstykkelse på ca. 200 μm. Intrikate sekvenser av spinnbelegg og eksponeringssykluser35, kostbare LIGA (litografi, galvanisering og støping) eller dyp reaktiv ionetsing (DRIE) prosesser36 er nødvendige for å oppnå større høyde- og aspektforhold. I skarp kontrast, som demonstrert i pionerarbeidet til Kumi et al. i 201037, tilbyr 2PP-teknikken et i hovedsak ubegrenset omfang for størrelsesforholdet mellom de trykte delene, som spenner fra submikrometer til millimeter. Her har mikroproduksjonsprosessen til en form med betydelig forskjell i høyde på delene blitt eksemplifisert, med over 100 ganger forskjell mellom mikrokanalenes høyde (5 μm og maksimal mugghøyde (545 μm; se figur 2).
Submikrometeroppløsning kan også lett oppnås ved å følge protokollspesifikasjonene som er skissert. Til sammenligning krever det kapitalinvesteringer å oppnå forbedrede muggoppløsninger gjennom UV-fotolitografi. Maskene med den fineste oppløsningen, som benytter kromavsetning på kvarts med en nominell oppløsning på 600 nm, er priset flere størrelsesordener høyere enn de lasertrykte overheadgjennomsiktighetsmaskene, som har en oppløsning på 250 μm35, men se arbeidet til Pirlo et al.41. For å være levedyktig for intern bruk, må en valgt metode være kostnadseffektiv. For mange biologiske laboratorier utgjør den totale kostnaden forbundet med konvensjonell myk fotolitografi eller direkte laserskriving en barriere. Selv om det er mulig å gjøre begge teknologiene mer tilgjengelige ved å kjøpe og montere de essensielle komponentene, krever denne tilnærmingen ytterligere ekspertise og krever fortsatt en betydelig investering. I denne sammenheng er et viktig poeng å vurdere det bredere spekteret av applikasjoner som kan oppnås gjennom direkte laserskriving. I motsetning til konvensjonell myk fotolitografi, hovedsakelig begrenset til formmikroproduksjon, viser 2PP 3D-utskrift bemerkelsesverdig allsidighet. Dens potensielle bruksområder spenner fra mikrofluidikk og mikrooptikk til integrert fotonikk og mikromekanikk. Dette gjør investering i denne teknologien attraktivt som et felles anlegg for flere og mangfoldige vitenskapelige felt. For eksempel er den 2PP-baserte metodikken utviklet i denne protokollen resultatet av et tverrfaglig samarbeid mellom nevrovitenskap og matematikkavdelinger i vår institusjon. I tillegg er fotoresistutviklingen et aktivt forskningsfelt, og kan potensielt utvide bruksområdet for 2PP 3D-utskrift. Et eksempel på dette er den nylige introduksjonen av IP-PDMS-harpiks. Ved polymerisering til strukturer med egenskaper som PDMS38, låser denne harpiksen opp potensialet for direkte mikrofabrikasjon av biokompatible komponenter som har kronglete overflater eller inneholder hulrom. Disse vanskelighetene står som barrierer for å oppnå lignende resultater gjennom konvensjonelle replikastøpingsprosedyrer.
Som en demonstrasjon av denne metoden ble det gitt bevis som tyder på utvikling av ensrettet tilkobling mellom to moduler i et modulært nevronnettverk. Mikroskalaformen, produsert av 2PP-teknikk, hadde nok utholdenhet til å gjennomgå flere PDMS-støping, og har den nødvendige mikroskalapresisjonen. Avslutningsvis strekker anvendelsesområdet for protokollen beskrevet i dette arbeidet utover det illustrerte tilfellet. Etter hvert som tilgangen til 2PP-utskriftsteknologien blir stadig mer utbredt, vil den opprinnelige investeringen som kreves for implementeringen reduseres, mens utvalget av potensielle applikasjoner utvides.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
MG anerkjenner økonomisk støtte fra EUs H2020 rammeprogram gjennom European Innovation Council (IN-FET-prosjektet, GA n. 862882, Arbor-IO-prosjektet, FLAG-ERA og Human Brain Project, ID 650003) og fra Sissa (Neuroscience Area). GN anerkjenner økonomisk støtte fra det italienske departementet for universitet og forskning (MUR) gjennom tilskuddet Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (matematikkområde). Vi takker M. Gigante, B. Pastore og M. Grandolfo for deres hjelp med 3D-utskrift, celledyrking og live-imaging, samt Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente og H.C. Schultheiss for diskusjoner. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). -------------------------------------- Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J.
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
- Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
