Summary
Mikrometre ölçeğinde 3D baskı, nöronal hücre kültürleri için polimerik cihazların hızlı prototiplenmesini sağlar. Bir prensip kanıtı olarak, nöronlar arasındaki yapısal bağlantılar, nörit büyümesini etkileyen bariyerler ve kanallar oluşturularak kısıtlanırken, bu tür manipülasyonun işlevsel sonuçları hücre dışı elektrofizyoloji tarafından gözlemlendi.
Abstract
Nöronal kültürler birkaç on yıldır referans deneysel bir model olmuştur. Bununla birlikte, 3D hücre düzenlemesi, nörit büyümesi üzerindeki uzamsal kısıtlamalar ve gerçekçi sinaptik bağlantı eksiktir. İkincisi, bölümlendirme bağlamında yapı ve işlev çalışmasını sınırlar ve kültürlerin sinirbilimdeki önemini azaltır. Sinaptik bağlantının yapılandırılmış anatomik düzenlemesine ex vivo yaklaşmak, ritimlerin, sinaptik plastisitenin ve nihayetinde beyin patofizyolojisinin ortaya çıkması için anahtar olmasına rağmen önemsiz değildir. Burada, mikrometre ölçeğinde polidimetil-siloksan (PDMS) kullanılarak polimerik hücre kültürü cihazlarının hızlı bir şekilde üretilmesini sağlayan bir 3D baskı tekniği olarak iki fotonlu polimerizasyon (2PP) kullanılmaktadır. Mikrofotolitografiye dayalı geleneksel replika kalıplama teknikleriyle karşılaştırıldığında, 2PP mikro ölçekli baskı, prototiplerin hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde geri dönüşünü sağlar. Bu protokol, modüler nöronal ağların kültürlenmesini amaçlayan PDMS tabanlı mikroakışkan cihazların tasarımını ve üretimini göstermektedir. Prensip kanıtı olarak, bağlantıyı fiziksel olarak sınırlamak için iki odacıklı bir cihaz sunulur. Spesifik olarak, ex vivo gelişim sırasında asimetrik bir aksonal büyüme tercih edilir ve bir odadan diğerine yönlendirilmesine izin verilir. Tek yönlü sinaptik etkileşimlerin fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için, birbirine bağlı nöronal modüllerin biyoelektrik aktivitesini izlemek için ticari mikroelektrot dizileri seçilmiştir. Burada, 1) mikrometre hassasiyetinde kalıplar üretme ve 2) sıçan kortikal nöronal kültürlerinde in vitro çok bölgeli hücre dışı kayıtlar gerçekleştirme yöntemleri gösterilmektedir. Maliyetleri düşürerek ve 2PP 3D baskının gelecekteki yaygın erişilebilirliğini azaltarak, bu yöntem dünya çapındaki araştırma laboratuvarlarında giderek daha alakalı hale gelecektir. Özellikle nöroteknoloji ve yüksek verimli nöral veri kaydında, basitleştirilmiş in vitro modellerin prototiplenmesinin kolaylığı ve hızı, in vivo büyük ölçekli sinir sistemlerinin deneysel kontrolünü ve teorik anlayışını geliştirecektir.
Introduction
Davranan organizmalarda nöronal aktiviteyi araştırmak çeşitli zorluklar sunar. Örneğin, beyin dokusuna fiziksel erişim, bütünlüğünü koruma ihtiyacı ile sınırlıdır, bu nedenle beynin yüzeysel bölgeleri daha kolay düşünülür. Sağlam doku içindeki belirli hedefleri izole etmek genellikle göz korkutucu bir iştir ve bazen imkansızdır. Ayrışmış homojen nöronal kültürler, bir nöral devrenin bireysel (alt) hücresel bileşenlerinin moleküler, biyokimyasal ve biyofiziksel özelliklerine kolay erişim sağlasa da, sağlam beynin gerçekçi bir bağlantısı ve anatomik organizasyonu kaybolur. Bu temel kısıtlamalar, yapının talep üzerine in vitro olarak inşa edilebildiği ve in vivo karmaşıklığın önlendiği bir orta yol elde etmek için araştırma çabalarına ilham verdi 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Özellikle, modüler nöronal kültürler, aşağıda açıklandığı gibi beyin fizyolojisinin temel sorularını ele almayı amaçlayan, son on yılda kapsamlı bir araştırma konusu olmuştur.
Organizasyon: İn vivo çalışmalar, beynin anatomik olarak hassas hücre tipleri ve projeksiyon dizileri ile katmanlar halinde yapılandırıldığını göstermektedir. Fonksiyonel tahliller, hassas bağlantı şemaları10,11 ile düğüm düzeneklerinde ve modüllerinde nöronal ağların organizasyonunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, bağlantı ve mikro devre motiflerinin rolü, ilgili çok sayıda sinapsın yanı sıra gelişim ve aktiviteye bağlı plastisitenin iç içe geçmiş etkileri nedeniyle in vivo olarak yeterince incelenemez.
Sinyal aktarımı: İn vivo veya rastgele in vitro kültürlerde, sinyal transferini değerlendirmek zordur. Aksonal iletim ve aksiyon potansiyelinin uzunluğu boyunca incelenmesi, elektriksel aktivitenin hücre dışı okumalarında yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlayarak, yüzey işlevselleştirme veya kimyasal modelleme yoluyla nörit büyümesinin yönlendirilmesini gerektirir12.
Çeviri alaka düzeyi: Patolojik koşullar boyunca sinaptik öncesi ve sonrası unsurların münhasır rolünü deşifre etmek, bu unsurlara ayrı ayrı erişmeyi gerektirir. Sinaptik öncesi ve sonrası unsurları etkili bir şekilde ayıran, kısıtlı bağlantıya sahip modüler kültürler, bu amaç için vazgeçilmez araçlardır13.
Nöronal kültürde bir tür yapı elde etmek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Genel olarak kimyasal ve fiziksel yüzey manipülasyonu olarak kategorize edilebilirler9. Eski yöntemler14,15, nöronal hücrelerin belirli (biyo)kimyasal bileşiklere bağlanma eğilimine dayanır. Bu, yapışkan veya çekici moleküllerin mikro ölçekli hassasiyetle bir yüzeye bırakılmasını ve ayrıntılı bir desenin izlenmesini gerektirir. Bu, hücrelerin yüzeyinin kısmen kaplanmasına izin verirken, istenen modeli takip ederek, kimyasal yöntemler doğal olarak sınırlıdır ve nörit büyüme rehberliğinde nispeten düşük bir başarı oranına sahiptir16. Akson yönlülüğü üzerinde tam kontrol, aksonal rehberliği şekillendirmek için geçici kimyasalların uzamsal bir gradyanının oluşturulmasını gerektirir17. İkinci yöntemler fiziksel yüzey manipülasyonunu içerir ve daha yaygın olarak nöronal ağları in vitro olarak yapılandırmak için kullanılır. Nöronal hücreler, mikroskobik odalar, duvarlar, kanallar vb. gibi geometrik sınırlamalarla istenen yerlerde fiziksel olarak sınırlandırılır ve polidimetilsiloksan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 gibi biyouyumlu bir polimeri şekillendirir ve mikroakışkan bir cihaza katılaştırılır. PDMS mikroakışkan üretimi için fiili yöntem, iki boyutlu bir maskenin mikro ölçekte desenlendiği ve UV'ye maruz kaldığında silikon bazlı bir malzemeyi seçici olarak aşındırmak için kullanıldığı yumuşak fotolitografi21'dir. Özetle, UV ile kürlenebilen bir reçine (yani, fotorezist), spin kaplama yoluyla bir silikon gofret üzerine kaplanır ve viskozitesi ve eğirme hızı tarafından belirlenen belirli bir yüksekliğe ulaşır. Daha sonra desenli maske fotorezistin üzerine konumlandırılır ve UV ışığına maruz bırakılır. Maske içindeki, ilgilenilen bölgelere karşılık gelen şeffaf alanlar, UV ışığının fotorezist moleküllerin lokalize çapraz bağlanmasını indüklemesine izin verecektir. Maruz kalmayan fotorezist alanları bir çözücü kullanılarak yıkanır ve bu da bir ana kalıp oluşumuna neden olur. Bu, tercih edilen bir elastomeri (yani PDMS) pişirmek için tekrar tekrar kullanılır ve daha sonra istenen geometrilerle istenildiği kadar çok kopya halinde kazınır. Böyle bir üretim yöntemi, mikroakışkan cihazları imal etmek için en yaygın yöntemdir22. Belki de yumuşak fotolitografinin temel sınırlamaları, kayda değer sermaye yatırımının ön koşulu ve biyolojik laboratuvarların gerekli tekniklere ve uzmanlığa aşina olmamasıdır. Maskenin hazırlanması ve karmaşık çoklu yükseklikte yüksek en-boy oranlı geometriler tasarlamak için gereken yumuşak fotolitografi adımları önemsiz değildir23 ve genellikle dış kaynak kullanımı gerektirir. Alternatif ve düşük bütçeli yöntemler önerilmiş olsa da, biyolojik prototiplemenin yüksek hassasiyet gereksinimlerini her zaman karşılamamaktadır24.
Burada, iki fotonlu polimerizasyona (2PP) ve eklemeli üretime dayanan alternatif bir üretim yöntemi sunulmaktadır. Basittir ve kendi başına gelişmiş mikrofabrikasyon ve mikrofotolitografi uzmanlığı gerektirmez. 2PP mikro üretiminin araştırma alanı 90'ların sonlarındaortaya çıktı 25 ve o zamandan beri üstel büyümeyetanık oldu 26. Bu tekniğin temel ilkeleri hakkında daha fazla bilgi başka bir yerde bulunabilir26. Kısaca, uyarma ışığı dürtüsünü üç boyutlu uzayda odaklayarak, 2PP, çoklu foton absorpsiyonunun yoğunluğa doğrusal olmayan bağımlılığından yararlanır. Bu, çok lokalize bölgelerde hassas ve seçici uyarılma sağlayarak sınırlı absorpsiyon kabiliyeti sağlar. Özünde, ışığa maruz kaldığında çözünürlüğü azalmış bir malzeme olan negatif tonlu bir fotorezist, düşük bir görev döngüsünde27 odaklanmış bir femtosaniye lazer darbesi ışınına tabi tutulur. Bu, düşük ortalama güçlerde yüksek yoğunluklu darbelere izin vererek, malzemeye zarar vermeden polimerizasyonu mümkün kılar. Foto-indüklenen radikal monomerlerin etkileşimi, fotorezist boyunca farklı bir hacme, yani boyutu lazer darbelerinin yoğunluğuna ve süresine bağlı olan voksel28'e kadar uzanan polimerizasyonu başlatan radikal oligomerlere yol açar.
Bu çalışmada iki bileşen sunulmaktadır: A) tek kullanımlık polimerik nöronal hücre kültürü cihazları üretmek için birçok kez yeniden kullanılabilen 3D baskılı bir kalıbın tasarımı ve hızlı imalatı (Şekil 1) ve B) düzlemsel nöronal hücre kültürü substratlarının yüzeyine mekanik olarak bağlanmaları veya hatta biyoelektrik sinyallerin çok bölgeli kayıtlarını yapabilen substrat entegre mikroelektrot dizilerinin yüzeyi.
Bir 3D mekanik modelin Bilgisayar Destekli Tasarımı burada çok kısaca açıklanmıştır ve 3D baskılı bir kalıba giden adımlar ve PDMS cihazlarının imalatı da detaylandırılmıştır.
Başlangıç 3B nesne modelini oluşturmak ve 2PP baskı sürecini kontrol etmek için bir STL dosyası oluşturmak için çeşitli bilgisayar destekli tasarım yazılımı uygulamaları kullanılabilir. Malzeme Tablosunda, listelenen ilk ve son uygulamalar ücretsizdir veya ücretsiz bir lisansla sağlanır. Bir 3B model oluşturmak her zaman bir 2B çizim oluşturmayı gerektirir ve bu çizim daha sonra sonraki modelleme adımlarında ekstrüde edilir. Bu kavramı göstermek için, protokol bölümünde genel bir 3D CAD yazılım tasarım süreci vurgulanır ve üst üste binen küplerden oluşan bir yapıya yol açar. Daha kapsamlı bilgi için, Materyal Tablosunda belirtildiği gibi bir dizi çevrimiçi eğitim ve ücretsiz eğitim kaynağı mevcuttur.
Elde edilen STL dosyası daha sonra 3D yazıcı tarafından yürütülecek bir dizi komuta çevrilir (yani dilimleme prosedürü). Kullanılan belirli 2PP 3D yazıcı için, STL dosyasını içe aktarmak ve tescilli Genel Yazı Dili (GWL) formatına dönüştürmek için DeScribe yazılımı kullanılır. 2PP baskı işleminin başarısı, başta lazer gücü ve tarama hızı, dikiş ve tarama-dilimleme mesafeleri olmak üzere çeşitli parametrelere bağlıdır. Bu parametrelerin seçimi, objektif ve fotorezist seçimi ile birlikte, tasarımın en küçük özelliklerine ve amaçlanan uygulamaya bağlıdır. Bu nedenle, farklı tasarım senaryolarının ve kullanım durumlarının gereksinimlerini karşılamak için parametre optimizasyonu gerekli hale gelir. Bu çalışma için, önerilen tarif IP-S 25x ITO Shell (3D MF), baskı parametreleri için bir konfigürasyon olarak kabul edilmiştir. Sonuç olarak, mekanik olarak stabil bir basılı parça, 3D baskı süresini en aza indirirken gerekli çözünürlükle basılır.
Bu çalışmada gösterilen kalıp tasarımı ve ilgili STL dosyası, bir hücre kültürünün alanını iki bölmeye ayırmak için kare bir çerçeve içerir: bir dış alan (yani, daha sonra Kaynak olarak anılır) ve bir iç alan (yani, daha sonra Hedef olarak anılır). Bu iki bölme, her biri keskin açılı sınırlarla karakterize edilen, nöritlerin Hedeften Kaynağa büyümesini özel olarak engellemek için tasarlanmış, ancak tersi olmayan ve bu nedenle iki alanda büyüyen nöronlar arasında yönlü bir sinaptik bağlantıyı teşvik eden mikro kanal kümeleri aracılığıyla bağlanır.
Daha önceki çalışmalar, nöritlerin yönlü büyümesini teşvik etmek için farklı mikro kanal geometrileri kullandı. Örnekler arasında üçgen şekiller18, kanal dikenli yapılar19 ve sivrilen kanallar20 bulunur. Burada, mikrokanalın sınırları boyunca keskin açılı bariyerler içeren ve aynı zamanda asimetrik girişlerle karakterize edilen bir tasarım kullanılmıştır. Bu mikro kanallar, kapalı bir iç kısım olan Hedef bölmesi ile dış alan olan Kaynak bölmesi arasında süreklilik sağlamaya hizmet eder. Mikrokanalların ilk kısmının Kaynak tarafından huni şekli, aksonal demetlerin oluşumunu ve bunların Kaynağı Hedefe bağlayan en kısa, yani düz çizgi boyunca büyümesini teşvik etmek için tasarlanmıştır. Keskin açılarla karşı karşıya kalınarak gerçekleştirilen üçgen boşluk, Kaynaktan kaynaklanan demetlerin hızlı bir şekilde vurulmasını ve mevcut alanın işgalini desteklerken, nöritlerin yol bulmasını etkili bir şekilde geciktirmeyi hedeflemek için Hedef tarafında daha büyük bir hacme sahiptir. Mikrokanalların uzunluğu için 540 μm seçimi, genellikle daha kısa olan dendritik büyümeyi etkili bir şekilde filtreler39. Ek olarak, 5 μm yükseklikleri, hücre somalarının mikro kanallardan nüfuz etmesini önler. Genel olarak, bu konfigürasyonun dış, Kaynak ve iç Hedef modüller arasında tek yönlü bağlantıyı teşvik ettiği kanıtlanmıştır ve burada birçok alternatif seçenek arasında bir ilke kanıtı olarak sunulmaktadır.
2PP kalıbı tarafından üretilen PDMS cihazları, cam lameller veya Petri kapları gibi yaygın hücre kültürü substratlarının yüzeyine tutturulabilirken, bu çalışmada ticari olarak temin edilebilen substrat entegre mikroelektrot dizileri kullanılmıştır. 3D tasarımı mikroelektrot dizisi düzenine göre optimize etmek için hiçbir çaba gösterilmemiştir ve mekanik bağlantı, yalnızca cihazı dizi boyunca konumlandırmayı amaçlayan stereomikroskopi rehberliği altında gerçekleştirildi ve her iki tarafta, Kaynak ve Hedefte bazı mikroelektrotları açıkta bıraktı. Bu, nöronal hücre kültürlerinde kısıtlı bağlantının fonksiyonel sonuçlarının ön değerlendirmesini sağlar.
Protocol
Hayvanların işlenmesiyle ilgili tüm prosedürler Avrupa ve İtalyan yasalarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Parlamentosu ve Konsey Direktifi [2010/63/EU]; 4 Mart 2014 tarihli İtalyan Hükümet Kararnamesi, no. 26), Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati'deki kurumsal OpBA (Hayvan Bakımı Komitesi) tarafından açıkça onaylandı ve İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından resmi olarak yetkilendirildi (Yetkilendirme No. 22DAB. N.UVD). Bunlar, bu çalışmada sunulan yöntemin deneysel olarak doğrulanması için kullanılmak üzere, ekilen sıçan beyin dokusundan duyarlı olmayan materyalin mevcudiyetine yol açtı.
1. 3D iki fotonlu polimerizasyon ile kalıp imalatı
- CAD dosyalarını oluşturma
NOT: Aşağıdaki adımlar, bilgisayar destekli tasarım yazılımı (yani SolidWorks) kullanan genel bir 3B tasarım iş akışını göstermektedir. Bu çalışmada (Şekil 2) açıklanan örnek STL tasarım dosyası, Ek Kodlama Dosyası 1 olarak ve Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110) aracılığıyla mevcuttur.- Bilgisayar destekli tasarım yazılımı masaüstü uygulamasını başlatın. Üst menü çubuğundan Yeni'yi seçin.
- Seçenekler arasından Parça: tek bir tasarım bileşeninin 3B temsili'ni seçin. Çizimin üstten görünümünü oluşturmak için Ctrl + 5 tuş kombinasyonuna basın.
- Yan panelden Çizim'i seçin ve Köşe Dikdörtgeni'ni seçin. Dikdörtgenin bir kenarını üzerine tıklayarak seçin. Parametreler paneli göründüğünde, uzunluğu 100 birim olarak ayarlayın.
- Bir öncekine dik kenar için adım 1.1.3'ü tekrarlayın: uzunluğunu 50 birime ayarlayın. Farenin sol düğmesini basılı tutarken üzerine sürükleyerek dikdörtgeni seçin.
- İlişki Ekle menüsünden, çizgiler arasındaki ilişkileri sınırlamak için Düzelt'i seçin.
- Çizimden çıkın ve 1.1.3'ten 1.1.5'e kadar olan adımları tekrarlayın, önceki çizimle örtüşen yeni (daha küçük) bir dikdörtgen oluşturun.
- Yan panelden Özellikler'i seçin ve Ekstrüde Patron/Taban'ı seçin: hem büyük hem de küçük dikdörtgenlerin derinliğini sırasıyla 5 ve 10 birim olarak ayarlayın.
- Dosya menüsünden, parçayı STL formatında kaydedin (yani, Standart Mozaik Dili).
- CAD dosyalarının işlenmesi
- STL dosyasını DeScribe uygulama yazılımı ile donatılmış bir kişisel bilgisayara aktarın.
- Describe uygulamasını başlatın ve Dosya menüsünden STL dosyasını açın. Modelin 3D gösterimi görünecektir.
- Sağ taraftaki menüdeki yönlendirme bölümünden, modeli uzayda uygun şekilde yönlendirmek için döndürün ve düzlemde ortalayın.
- Sağ taraftaki menünün Ölçeklendirme bölümünü seçerek genel ölçeklendirmeyi ayarlayın.
- Üstteki açılır menüden IP-S 25x ITO Shell (3D MF) tarifini seçin. Bu, fotorezist olarak IP-S'yi, objektifin büyütme gücü için 25x'i, baskı alt tabakası olarak İndiyum Kalay Oksit (ITO) kaplı alt tabakayı ve orta boy özelliklere (MF) sahip çalışma modu olarak kabuk ve iskele baskısını belirtir.
- Hem kabuk hem de yapı iskelesi için Dilimleme mesafesini 1 μm ve Tarama mesafesini 0,5 μm olarak seçerek sihirbazda gezinin.
- İçe aktarma sihirbazının çıktı adımında, bölme altında, blok boyutunu X = 200 μm, Y = 200 μm ve Z = 265 μm ve blok ofsetini X = 133 μm, Y = 133 μm ve Z = 0 olarak tanımlayarak mikrokanalların hassas yapılarının dikiş hatlarından etkilenmemesini sağlayın.
- Tarama modu olarak varsayılanı kullanın: XY düzlemi için Galvo ve Z ekseni için Piezo.
- Kaydet'e basın ve bir sonraki metin menüsünde, baskının en alt katmanındaki lazer gücünü %75'e düşürmek için var $baseLaserPower = $shellLaserPower satırını var $baseLaserPower = 75 ile değiştirin.
- Yukarıdaki adımlarla elde edilen GWL dosyalarını 2PP 3D baskı için ayrılmış iş istasyonuna aktarın.
- 3D baskı ve numune geliştirme
- NanoWrite uygulama yazılımını başlatın. Yazıcı başlatıldıktan sonra, alt tabaka tutucuyu takmak ve objektifi monte etmek için yazılım arayüzündeki Değişim Tutucu'ya tıklayın.
- 25x objektifi burunluk üzerinde uygun konuma monte edin. Dirençleri ölçmek için ayarlanmış bir elektronik multimetre ile cam alt tabakanın hangi tarafının ITO ile kaplandığını belirleyin: okuma, 100-300 Ω gibi düşük değerler olmalıdır, ancak yalnızca ITO kaplı taraf için.
- Cam alt tabakayı, ITO kaplı tarafı yukarı doğru yönlendirerek tutucuya yerleştirin. Sıkıca yerinde tutmak için bant kullanın.
- Kimyasal çeker ocak altında, cam alt tabakanın ortasına bir damla IP-S fotorezist uygulayın.
- Tutucuyu, reçine damlası objektife bakacak şekilde (yani aşağı) 3D yazıcıya yerleştirin.
- Yazılımın Dosya menüsü aracılığıyla GWL dosyalarını yükleyin. Hedefi reçine damlasına yaklaştırmak için Yaklaşım Örneği'ni seçin.
- İki malzemenin kırılma indeksi farkına bağlı olarak ITO-fotorezist baskı arayüzünün algılanmasına izin vermek için Arayüz Bul'u seçin.
- Yazdırmayı başlatmak için İşi Başlat'ı seçin. Yazdırma bittiğinde, tutucuyu almak için Değişim Tutucu'ya basın.
- Tutucuyu geri alın ve alt tabakayı yazdırılan parça ile yavaşça çıkarın. Basılı parçayı geliştirmek için cam alt tabakayı çeker ocak altında 20 dakika propilen glikol metil eter asetata (PGMEA) daldırın.
- Alt tabakayı PGMEA'dan çıkarın ve 5 dakika boyunca izopropanol içine daldırın. Yazdırılan parçanın kimyasal çeker ocak altında kurumasını bekleyin.
- Baskı sonrası işlem ve kalıp montajı
- Yazdırılan parçayı 365-405 dakika boyunca yeterli güçle UV ışığına (yani 5-20 nm) maruz bırakarak kürleyin (güç ayrıntıları için Tartışmaya bakın).
- Laminer akış başlığının altında, yazdırılan parçayı cam alt tabakadan yavaşça çıkarın. 35 mm x 10 mm'lik bir Petri kabının dibine ~2 μL reçine damlatın.
- Yazdırılan parçayı dikkatlice damlanın üzerine yerleştirin ve reçinenin parçanın altından akmasına izin verin. Basılı parçayı 5 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak daha da sertleştirin.
- Petri kabını kapağıyla kapatın ve 80 °C'de 30 dakikadan fazla ısıyla kürlenmesi için fırına aktarın. Yazdırılan parçanın deformasyonunu veya kırılmasını önlemek için fırını önceden ısıtmayın. Sertleştikten sonra, yazdırılan kısım Petri kabının dibine kalıcı olarak takılacaktır. Bundan böyle basılan ve monte edilen kısım kalıp olarak anılacaktır.
2. Kalıp ve hücre kültürü substratlarından PDMS cihazı imalatı
- PDMS cihazı imalatı
- Polimerize edilmemiş PDMS'nin baz ve sertleştiricimaddesinin 20 mL 10:1 (ağırlık oranı) karışımını hazırlayın. Her cihaz için ve gerekli yüksekliğe bağlı olarak 1-2 mL PDMS karışımı yeterlidir. Fazla polimerize edilmemiş PDMS'yi daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
- Laminer akış başlığı altında, karışımı 4 dakika boyunca iyice karıştırın. Karışım hava kabarcıklarını eşit şekilde hapsettiğinden opak hale gelecektir.
- Karışımı 50 μL'lik bir μtüpe aktarın ve karışımdaki hava kabarcıklarını gidermek ve net bir görünüm elde etmek için 168 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Kalıba 10 μL hidrofobik ajan (yani, Repel-silan ES) uygulayın ve polimerize PDMS'nin daha sonra kalıptan düzgün bir şekilde ayrılmasını sağlayarak 7 dakika dinlenmesine izin verin.
- Kalıbı 1x %70 etanol ve 2x deiyonize (DI) su ile durulayın. Kalıbın laminer akış başlığının altında kurumasını bekleyin.
- PDMS karışımını, cihazın amaçlanan son yüksekliğine ulaşılana kadar yavaşça kalıba dökün. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, karışımı yavaşça ve kalıbın yüzeyine yakın bir mesafeden dökün.
- Kalıbın üzerini örtün ve kürlenmesi için önceden ısıtılmış ve 80 °C'de stabilize edilmiş bir fırına 18 dakika aktarın. 5 mm'den fazla ve 1 cm'ye kadar olan cihaz yükseklikleri için kürlenme süresini 18 dakikadan 25 dakikaya uzatın.
- Laminer akış başlığının altında, kürlenmiş PDMS bloğunu kalıptan nazikçe ayırın ve bir cam Petri kabının içine en az 10 dakika boyunca izopropanol içine daldırın. İzopropanol, çapraz bağlanmamış PDMS'yi ortadan kaldırır. PDMS bloğunu her zaman kapalı tutun.
- İzopropanolü yenileyin ve stereo mikroskop altında, cihazın merkezi kare bölümünü (bu çalışmada Hedef alan olarak tanımlanmıştır) oftalmik bir bıçak bıçağıyla dikkatlice kesin. Ardından, cihazın nihai şeklini elde etmek için kenarları daha fazla kesmeye devam edin.
- Cihazı izopropanolden alın ve 30 dakika etanole batırın ve ardından steril DI su ile 3 kez durulayın. Bu noktadan itibaren steriliteyi koruyun.
- Laminer akış başlığının altında, cihazı kapağını hafifçe açık bırakarak yeni bir Petri kabına aktarın. Tamamen kurumasını bekleyin.
- Cihaz montajı ve hücre kültürü substratlarının hazırlanması.
- Her bir mikroelektrot dizisini (MEA'lar) 30 dakika boyunca %70 etanole batırarak sterilize edin ve ardından steril DI su ile 3x durulayın.
- Steril ince cımbız kullanarak, laminer akış başlığı ve stereomikroskop altında, PDMS cihazını bir MEA'nın iç alanına monte edin. PDMS cihazının bir tarafını, alt tabakaya entegre mikroelektrotlar içeren iç MEA alanının ortasına hizalayın, böylece hem Kaynak hem de Hedef alanlardan birkaç mikroelektrot açıkta kalır (bkz. Şekil 2).
NOT: Bu çalışma için, MEA mikroelektrotlarının PDMS cihazı mikrokanalına hizalanması gerekli değildir. PDMS cihazı ile MEA yüzeyi arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için cihaza hafifçe basılması gerekebilir. Ne pahasına olursa olsun mikroelektrotlara cımbızın ucuyla dokunmaktan kaçının. - Hava plazması yoluyla yüzey aktivasyonunu etkinleştirmek için üzerinde PDMS cihazı bulunan MEA'yı plazma temizleyici haznesine yerleştirin. Haznenin 4 dakikalık bir vakum pompası tahliyesi ile işleme başlayın. Ardından, kontrollü hava tahliyesine izin vermek için hava valfini hafifçe açın. Hava valfini kapatın ve RF güç seviyesini 10 W ile 18 W arasında ayarlayarak plazma indükleyicilerini açın.
- Parlayan bir ışık göründüğünde, işlemin 80 saniye çalışmasına izin verin. Ardından, plazma indükleyicisini kapatın, vakum pompası valfini kapatın ve hava valfini yavaşça açın. MEA'yı almak için odayı açın.
NOT: Plazma işlemi, MEA'ların steril olmayan bir ortama maruz bırakılmasını içeriyorsa, steriliteyi sağlamak için her MEA'yı UV ışığı altında 30 dakika boyunca laminer akış başlığına yerleştirin. - MEA'ya 1 mL polietilenimin (PEI) ağırlıkça% 0.1 / hacim çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. PEI solüsyonunu aspire edin ve steril DI su 5x ile durulayın. MEA'ya 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücre tohumlamadan önce inkübe edin.
3. Nöronal hücre kültürü ve elektrofizyoloji
- Diseksiyon ortamını, sindirim solüsyonunu ve 1-3 solüsyonlarını önceden hazırlayın (bakınız Tablo 1).
- Ayrışmış nöronal hücre kültürü.
- 0-1 günlük yenidoğan bir Wistar sıçan yavrusunu burnundan nazikçe kavrayın ve keskin bir makas kullanarak hızlı bir şekilde kafa kesme işlemi gerçekleştirin.
- Kafa derisini soyun, ince makas kullanarak kafatasının sagital orta çizgisi boyunca bir kesi yapın ve ardından beyinciğin birleştiği yerde kafatasından bir koronal kesik oluşturun.
- Kafatasını çıkarın, beyni ince bir spatula ile çıkarın ve soğuk (4 °C) diseksiyon ortamına aktarın.
- Subkortikal dokuyu, hipokampusu ve meninksleri çıkarın. Dokuyu küçük parçalar halinde doğrayın (yani 1-2 mm3) ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Solüsyonu atın ve taze diseksiyon ortamı kullanarak dokuyu durulayın, ardından sindirim ortamı ile yıkayın.
- Sindirim ortamını atın, ardından 1 mL Çözelti 1 ekleyin. Karışımı 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Çözelti 1'i atın ve dokuyu taze diseksiyon ortamı ile durulayın. Daha sonra 1 mL çözelti 2 ekleyin ve karışımı 4 °C'de 10 dakika tutun.
- Solüsyon 2'yi atın ve taze diseksiyon ortamı kullanarak dokuyu durulayın. Ardından 1 mL çözelti 3 ekleyin. Çözeltiyi 20 ila 30 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri mekanik olarak ayırın. Ayrışmış hücrelerin düzgün bulanık bir karışımı ortaya çıktığında, diseksiyon ortamı ekleyerek hacmini 3 mL'ye yükseltin.
- Karışımı 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyerek hücre peletini toplayın. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL önceden ısıtılmış kültür ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücreleri sayın (yani bir hücre sayma odası ile) ve hücre tohumlama çözeltisinin yoğunluğunu buna göre ayarlayın.
- Her MEA'yı, nominal hücre yoğunluğu 1.8 x 106 (~ 6500 hücre/mm2) olan 1 mL tohumlama çözeltisi ile tohumlayın. Tohumlanmış MEA'ları nemli bir inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ortamı her 2 günde bir taze (yani haftalık olarak yapılan) kültür ortamıyla değiştirin.
- Hücre dışı elektrofizyoloji
NOT: Ayrışmış nöronal hücre kültürleri, in vitro olarak 2-3 hafta sonra tamamen olgun bir elektriksel fenotipe ulaşır. Aşağıdaki bölümler, modüllerde kültürlenen nöronal popülasyonlardan herhangi birini, yani Kaynak veya Hedef'i elektriksel olarak uyarmak ve aynı anda her iki popülasyonun aktivitesini olgun ağlarda kaydetmek için ticari bir MEA uygulama yazılımı (Deneyci) kullanan bir hücre dışı stimülasyon protokolünü açıklamaktadır.- Bir MEA'yı yavaşça monte edintage çok kanallı elektronik amplifikatörün, kuru bir inkübatörün (37 °C,% 5 CO2) içine ve 10 dakika bekletin. Özel bir PDMS kapağı ayrı olarak üretilebilir ve su buharlaşmasını azaltmak ve steriliteyi korumak için her MEA için sıkı bir kapak olarak kullanılabilir.
- Experimenter yazılımını başlatın. Örnekleme hızını 25 kHz olarak ayarlayın ve DAQ'yu Başlat'a basarak veri alımını başlatın. Veri Görüntüleme panelinde, her kanal için hücre dışı olarak kaydedilen etkinliğin ham izleri görüntülenir.
- Spontan aktiviteyi izleyin ve Kaynak veya Hedef taraf mikroelektrotlarından ağ çapında spontan senkronize aktivite patlamaları sırasında aktif olan 3 çift komşu mikroelektrotu görsel olarak tanımlayın ve seçin.
- Yazılımın stimülatör panelinde, bipolar konfigürasyonda uyarıcı mikroelektrot çiftlerinin her biri için parametreleri yapılandırın: bir bifazik darbe dalga formu seçin ve tepe genliklerini ± 800 mV'a ve darbe süresini 200 μs'ye ayarlayın.
- Kayıt cihazını ayarlayın ve stimülasyondan önce 300 ms'lik bir süre için stimülasyondan sonra 1000 ms'ye kaydedin.
- Kaynak ve Hedef taraf için 3.3.3 ile 3.3.5 arasındaki adımları, gerekli sayıda tekrar için araya serpiştirilmiş bir şekilde tekrarlayın.
Representative Results
PDMS cihazlarının hızlı prototiplenmesi için 2PP 3D baskının kullanımını örnekleyen 2 bölmeli polimerik (nöronal) hücre kültürü cihazının üretimi burada rapor edilmiştir. Spesifik olarak, tek yönlü sinaptik bağlantıya sahip modüler nöronal ağlar için bir cihaz üretilmekte ve fonksiyonel karakterizasyonu çok bölgeli hücre dışı elektrofizyoloji açısından sunulmaktadır. Kısaca, piyasada bulunan bir 3D yazıcı kullanılarak, doğrudan lazer yazımı yoluyla mikrometre ölçeğinde bir kalıp gerçekleştirilmiştir. Özellikle, yazıcı, 780 nm merkez dalga boyuna ve 80 ila 100 fs süreye sahip lazer darbeleri aracılığıyla 50 mW'lık bir güç sağlar. Üretim işlemi sırasında, lazer ışını, x ve y eksenleri için galvo tarayıcıyı ve z ekseni için piezo aşamasını kullanarak baskı hacmini taramak için yazıcının objektifi (25x, NA = 0.8) aracılığıyla negatif tonlu fotorezist (IP-S) üzerine odaklanır. Baskı hacmi, toplam boyutu 6500 mm x 6500 mm x 545 mm ve nominal hacmi 12.423 mL olan bir kalıbı gerçekleştirmek için 200 mm x 200 mm x 265 mm'lik bloklara uygun şekilde bölündü. Şekil 2A , kalıbın boyutlarını ve özelliklerinin boyutunu vurgulayan 2 boyutlu bir taslağını temsil ederken, Şekil 2B , bir MEA üzerine monte edilmiş bitmiş cihazın yakın çekim bir fotoğrafını göstermektedir. Önceki bölümde açıklandığı gibi hazırlanan kalıplar dayanıklıydı ve PDMS cihazlarını imal etmek için 50 defadan fazla tekrar kullanılabilir.
Basılı kalıp, daha sonra nöronal elektriksel aktivitenin çok bölgeli hücre dışı kayıtları için ve bir prensip kanıtı olarak kullanılmak üzere cam-substrat entegre mikroelektrot dizileri dizilerinin (MEA) iç alanına monte edilen PDMS cihazının dökümü için kullanıldı. Ticari substrata entegre MEA'lar, her bir kültür bölmesinde bulunan bir mikroelekrod alt kümesi tarafından hücre dışı olarak verilen uzamsal olarak lokalize elektriksel uyaranlara yanıt olarak modüler kültürlerin aktivitesini izlemek için kullanıldı. Her MEA, 30 μm çapında ve 100 μm elektrotlar arası aralıklı 120 Titanyum nitrat (TiN) mikroelektrot içerir. Şekil 2C-D, PDMS cihazının MEA'nın üstüne yerleştirilmesini göstermektedir. Cihazın bireysel mikro kanallarının geometrik özellikleri, Şekil 2C'de gösterilen odanın genel ayak izi ile birlikte, kültürlenmiş nöronların bölümlere ayrılmasına yol açar. Bunlar, ait oldukları bölmeye, cihazın dış alanına (Kaynak) veya cihazın iç alanına (Hedef) göre ayırt edilebilir. Kaynaktan Hedefe sınırlı olan tercih edilen aksonal kılavuzluk, mikro kanalların keskin açılı kenarları tarafından belirlenir. Şekil 2D, polimerik cihazın MEA üzerindeki yerleşimini ve Kaynak veya Hedef bölmelerinde bulunan kayıt elektrotlarının göreceli kapsama alanını göstermektedir. Cihazın mikrokanallarının iç kısmının bir veya daha fazla MEA mikroelektrot sırasına hassas bir şekilde hizalanmasının, vaka çalışmamız için gerekli olmadığını veya takip edilmediğini unutmayın.
Asimetrik nörit büyümesinin temsili kanıtı, canlı görüntülemede, hücre kaplamasından 6 gün (Şekil 3A) ve 2 gün sonra (Şekil 3B-D) floresan etiketli nöritleri gösteren ex vivo geliştirme sırasında Şekil 3'te verilmiştir. Cihazın Hedef tarafındaki nöritler, uzayda ilerlemelerini engelleyen engeller olarak keskin açılı engellerle karşılaşırken, Kaynak tarafından kaynaklanan nöritler kesintisiz büyüyerek kanalları geçti. Bu asimetri, tasarımdan açıkça amaçlandığı gibi, Kaynaktan Hedefe çıkıntı yapan iki bölmedeki nöronlar arasında tek yönlü bir aksonal bağlantıyı destekler. Bu sonuç, iki bölmenin her birinde alternatif olarak verilen uyaranlar tarafından uyandırılan elektriksel tepkilerin (işlevsel) bir elektrofizyolojik değerlendirmesi ile de desteklenmektedir.
3-4 hafta sonra in vitro nöronal ağlar tam olgunluğaulaştığında 29,30, iki bölme arasındaki fonksiyonel bağlantı, kısa elektriksel uyaranlar verildikten ve uyandırdıkları nöronal tepkiler izlendikten sonra araştırılabilir31. 800 mV genliğe sahip bifazik elektriksel darbeler daha sonra alternatif olarak sadece Kaynağa veya sadece Hedef popülasyonlara (N tekrarlar = 150, N modüler kültürler = 6) uygulandı, bipolar bir konfigürasyonda 3 yan yana düzlemsel mikroelektrot çifti tarafından iletildi ve serpiştirilmiş bir şekilde. Bu nedenle, 3 çift elektrot, MEA'nın Kaynak alanı veya MEA'nın Hedef alanı içinde bulunabilir. Her bir uyaran tarafından uyarılan elektriksel tepkiler, bir yayılma gecikmesinden sonra tüm MEA mikroelektrotları tarafından tespit edilebilir. Kayıtlar 25 kHz/kanal örnekleme hızı ile gerçekleştirildi ve elde edilen hücre dışı ham elektrik sinyalleri 16 bitlik analogdan dijitale dönüşüm çözünürlüğünde sayısallaştırıldı. Herhangi bir ani sıralama gerçekleştirmeden, hücre dışı aksiyon potansiyellerinin oluşum zamanını tespit etmek için bir eşik geçişi tepe algılama algoritması32 çevrimdışı olarak kullanıldı. Şekil 4A-B, uyaran iletiminin konumuna bağlı olarak 150 kez tekrarlanan, uyarılmış yanıtların güçlü bir asimetrisini açıkça ortaya koymaktadır ve bu da geometrik kısıtlamaların bağlantının tercih edilen yönlülüğü üzerinde önemli bir işlevsel etkisi olduğunu göstermektedir. Aslında, Kaynak tarafının uyarılması üzerine, Kaynak nöronal popülasyonunun ateşleme hızı - peri-uyaran spike-times histogramı hesaplanarak tahmin edilir - beklendiği gibi artarak tam bir ağ patlamasıaksiyon potansiyeli patlaması 33,31,34 ve bunu bir gecikmeden sonra Hedef popülasyonun ateşleme hızında bir artış izledi. Bununla birlikte, stimülasyon Hedef popülasyon içinde verildiğinden, Kaynak popülasyon çoğunlukla sessiz kalırken, yalnızca Hedef popülasyonun ateşleme hızı arttı. Şekil 4C-D, polimerik cihaz olmadan (yani yapılandırılmamış bir nöronal kültür) bir kontrol kültüründe aynı uyaran/tepki paradigmasını tekrarlar, hücre dışı uyaranlar da 4 tekrarla iletilmiştir. Bu tür kontrol koşulları için, her iki uyaran tarafından uyandırılan tepkilerde asimetri meydana gelmedi. Modüler ağlarda kullanılanla eşleşen uyaranları iletmek için kullanılan MEA mikroelektrotlarının alt kümesi, uyaran iletiminin konumu, tüm popülasyondan benzer bir uyarılmış tepkiye yol açtı. Bu, PDMS cihazının iki bölme boyunca tek yönlü sinaptik bağlantıyı desteklediğini doğrular. Genel olarak, modüler kültürlerde uyarılan asimetrik yanıtlar (N = 6) ve kontrol kültürlerinde uyarılan simetrik yanıtlar (N = 4), bölümlere ayrılmış bir in vitro sistemin kısıtlı bir anatomik bağlantısını güçlü bir şekilde gösterir. Şekil 4'ü oluşturmak için kullanılan elektrofizyolojik veriler ve komut dosyaları Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990) aracılığıyla kullanıma sunulmuştur.
Şekil 1: 2PP mikro kalıp imalatının ve PDMS replika kalıplamanın taslağı. (A) CAD'de bir 3D model tasarlanır ve Standart Mozaik Dili (STL) formatındaki dosyada dışa aktarılır, (B) bir damla reçine (IP-S) içinde lazer kaynaklı polimerizasyon yoluyla 2 fotonlu 3D baskısı talimatı verilir. (C) Ortaya çıkan yapı, PDMS kopyalarının tekrarlanan imalatı için bir kalıp olarak kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir polimerik (nöronal) hücre kültürü PDMS cihazının kurum içi hızlı prototipleme örneği. (A) 24 saatten daha kısa bir sürede, mikro ölçekli eklemeli üretim, bir CAD modelinden 3D baskılı bir master'a geçmeye, PDMS gibi biyouyumlu elastomerlerle bir kopya kalıp olarak hemen ve tekrar tekrar kullanılmasına izin verir. (İ.Ö.) Elde edilen PDMS cihazları, burada bir dizi mikroelektrot ile temsil edilen bir nöronal hücre kültürü düzlemsel substratına bağlanır. (A)'daki spesifik numune tasarımı için iki oda tanımlanmıştır: biri Kaynak olarak adlandırılır ve S ile gösterilir, diğeri ise Hedef olarak adlandırılır ve T ile gösterilir. (D) Her odacıkta kaplanan nöronlar, nöritlerini yalnızca bir dizi mikro kanal aracılığıyla büyütebilir. (C) 'de stereo mikroskopi rehberliği altında uygun şekilde hizalandığında, iki substrat entegre mikroelektrot seti açıkta bırakılır, böylece her iki bölmede bulunan yakındaki nöronların biyoelektrik aktivitesi uyarılabilir ve kaydedilebilir. Burada, mikroelektrotların tek tek mikrokanallar içinde hizalanmasının bu ilke kanıtının önceliği olmadığını unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücre geçirimsiz floresan raportör moleküllerinin canlı görüntülemesi, hücre kaplamasından birkaç gün sonra nöronlar tarafından uzatılan nöritleri tanımlar. (A-D) Şekil 1 ve Şekil 2'den (N = 4, 128 ayrı mikrokanal) üretilen cihazın modüler nöronal kültürlerinin temsili konfokal floresan mikrografları, hücre kaplamasından 2 ve 6 gün sonra elde edilmiştir. (B-D) Daha fazla görünürlük için 40x büyütme ve mikrografların ters gri tonlaması. Kaynak ve Hedef bölmelerinden gelen mikro kanalların uçları sırasıyla S ve T ile gösterilir. (A), kaplamadan 6 gün sonra, Kaynak (yani iç kare alan) ve Hedefin (yani dış alan) hücrelerle dolu olduğu kültürün geniş tarama görüntüsünü gösterir. (B) ve (C ), kaplamadan 2 gün sonraki daha erken zaman noktasında, sırasıyla mikrokanalların Kaynakta ve Hedef taraflarında nöritlerin büyümesini gösterir. Küçük siyah üçgenler, görünüşe göre yalnızca Kaynaktan kaynaklanan varsayılan akson demetleri terminallerinin temsili örneklerini gösterir. Ok şeklindeki mikro kanalların sınırları, geçişlerinin kesintisiz olduğu ve Hedefe doğru yönlendirildiği kenar (B) boyunca nöritlerin uzamasına işaret eder. Ters yönde ve bir mikrokanalın (C) Hedef ucunun yanında, Hedeften kaynaklanan ve Kaynak tarafına ilerleyen nöritler keskin köşelerde sıkışır. (D) ayrıca bir mikrokanal içindeki nörit büyümesinin ayrıntılarını ortaya çıkarır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PDMS cihazı ile ve PDMS cihazı olmadan nöronal elektriksel yanıtların fonksiyonel karakterizasyonu. MEA'lar, hücre kültürü substratları olarak kullanıldı ve bipolar bir konfigürasyonda verilen çok kısa (yani, 200 μs, 0.8V) bifazik elektriksel stimülasyon darbesi tarafından uyandırılan ağ çapında sivri tepkileri ölçmek için kullanıldı. Şekil 2'deki PDMS cihazı ile, Kaynaktan (kırmızı) ve Hedeften (mavi) kaydedilen nöronal spiking tepkileri, uyaranın nereye iletildiğine bağlı olarak farklılık gösterir. Varsayılan aksonal, sinaptik ve entegrasyon gecikmeleri (A)' da belirginleşir, ancak (B)'de belirginleşmez, bu da tercih edilen bir sinaptik bağlantının (yani Kaynaktan Hedefe) var olduğunu düşündürür. (C-D) Kontrol koşulları altında (yani, PDMS cihazı olmadan), iki farklı MEA mikroelektrot setinde tespit edilen uyarılmış yanıtlar, uyaran iletim konumuna bağlı değildir. Grafiklerdeki çizgileri saran soluk tonlu gölgeleme, ortalamanın anlık standart hatasını gösterir (N uyaran = 150). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm Adı | Kompozisyon | ||
| polietilenimin (PEI) %0,1 | 1 mL PEI stok çözeltisi, 9 mL steril deiyonize (DI) su. | ||
| Kültür ortamı (50 mL) | 20 μM Glikoz, 50 μg/mL Gentamisin, 50 μM L-glutamin ve %10 Isıyla İnaktive At Serumu ile desteklenen Minimum Esansiyel Ortam (MEM). | ||
| Diseksiyon ortamı (1000 mL) | Hanks Dengeli Tuzlar 9.52 g, Sodyum bikarbonat 350 mg, HEPES 2.83 g, D- (+) - Glikoz 6 g, Kinürenik asit (son konsantrasyon 200 μM), D-AP5 (son konsantrasyon 25 μM), Gentamisin 250 μl, Sığır Serum Albümini 300 mg, Magnezyum sülfat 1.44 g. PH'ı 7.3'e ayarlayın, ışıktan koruyun ve 4°C'de saklayın. | ||
| Sindirim ortamı (100 mL) | Sodyum klorür 800 mg, Potasyum klorür 37 mg, di-Sodyum hidrojen fosfat 99 mg, HEPES 600 mg, Sodyum bikarbonat 35 mg, Kinürenik asit, 200 μL (100 mM stoktan), D-AP5 100 μL (stoktan 25 mM). PH'ı 7.4'e ayarlayın, ışıktan koruyun ve 4 °C'de saklayın. | ||
| Çözüm 1 | Tripsin 5 mg, Deoksiribonükleaz I 1.5 mg, 2 mL Sindirim ortamında. | ||
| Çözüm 2 | Tripsin inhibitörü 5 mg, 5 mL Diseksiyon ortamında. | ||
| Çözüm 3 | Deoksiribonükleaz I 1.5 g, 2.5 mL Diseksiyon ortamında. | ||
Tablo 1: Çözüm tablosu. Ürün açıklamaları için malzeme tablosuna bakın.
Ek Kodlama Dosyası 1: STL tasarım dosyası, Şekil 2A'da gösterilen yapıya karşılık gelir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Onlarca yıllık olmasına rağmen, mikrometre ölçekli PDMS tabanlı replika kalıplamada 2PP teknolojisinin uygulanması yeni bir gelişmedir43,44. Bu bağlamda, kullanıcıların bu çalışmayı etkili bir şekilde yeniden üretmelerine yardımcı olmak için aşağıda bir dizi nokta tartışılmaktadır.
3B model tasarımı için, modelde delikler veya kendi kendine kesişimler olmadığından emin olun. ASCII kodludan daha küçük dosya boyutu ayak izi için STL olarak kaydederken ikili dosya biçimine ayrıcalık tanıyın. Bu, özellikle karmaşık geometrilere sahip tasarımlar ve mililitre genişliğindeki nesneler için faydalıdır. İkili STL dosyalarının kullanılması, daha sonra mekanik parçayı 3d yazdırılacak şekilde hazırlama sürecinde düşük CPU yükü anlamına gelir. Unsurların STL dosyasındaki fiziksel boyutları boyutsuz birimlerle temsil edilir. STL dosyasının sonradan işlenmesi sırasında, birimler mikrometre olarak yorumlanır. Bu nedenle, dosyayı hazırlarken ilgilenilen birimin, yani mikrometrenin önceden benimsenmesi önerilir. Basılı modelin doğruluğu, mozaikli üçgenlere yaklaşan yüzey sayısı ile belirlenir. Yetersiz sayıda yüzey için istenmeyen yüzey pürüzlülükleri ortaya çıkacaktır. Bununla birlikte, çok sayıda yüzeyle aşırı yüksek doğruluğu hedeflemek, yüksek hesaplama yükü pahasına gelir ve dosya işlemenin yavaş olmasına neden olur.
3D baskı için, baskı sırasında, 3D fiziksel nesne, xy düzleminde hızlı galvo taraması ve z yönünde piezo hareketi kullanılarak oluşturulur. Bu, femtosaniye lazer ışınını herhangi bir 3D voksel içinde odaklar. Bununla birlikte, yazdırma yapıları galvo'nun ve piezo'nun uzamsal kapsama aralıklarından daha büyük olduğunda, nesnenin programlı olarak bloklara bölünmesi gerekir. Bu, milimetre boyutunda basılı parçalar için bir gereklilik olsa da, bloklar arasındaki bağlantılar (kusurlu) dikiş çizgileriyle ilişkilidir. Blok sayısının dikkatli bir şekilde optimize edilmesi ve dikiş çizgilerinin x, y ve z yönlerinde yerleştirilmesi, nihai nesnenin kritik geometrik özelliklerinin dikiş çizgileriyle bozulmasını önlemek için çok önemlidir. Baskı arayüzünde çeşitli nedenlerle (örneğin, alt tabakalar, fotorezistin safsızlıkları ve homojen olmayanları) kabarcıklar oluşabilir ve yazdırılan yapının kalitesini ve bütünlüğünü olumsuz yönde etkileyebilir. Ayrıca, daha yüksek lazer gücü, oluşumlarında bir artışa neden olabilir. Yazdırılan parçanın en alt katmanındaki lazer gücünü azaltmak, kabarcık oluşumu olasılığını en aza indirecektir. Parçanın tamamının sağlam bir yapı olarak basılmasına alternatif olarak, kabuk ve iskele yöntemi düşünülebilir. Parçanın (kabuğun) sadece dış yüzeyinin yanı sıra içindeki üçgen prizma elemanlarının basılmasını içerir. Bu elemanlar, polimerize edilmemiş reçineyi küçük ceplerde tutan yatay katmanlarla (iskele) ayrılır. Bu yöntem, özellikle milimetre boyutundaki yapılar için geçerli olan baskı süresini önemli ölçüde kısaltır. Bununla birlikte, polimerize olmayan reçine kaldığından, tam mekanik stabiliteyi sağlamak için baskı sonrası UV'ye maruz kalma zorunludur, ancak bu adım, yazdırılan parçanın herhangi bir deformasyonunu önlemek için nazikçe gerçekleştirilmelidir. Kürlenme sonrası süre, tercih edilen reçineye, parçanın kalınlığına ve UV gücüne40 bağlıdır. En iyi sonuçlar için, UV'ye maruz kaldıktan sonra bir damla fotorezist kullanarak ve kesit kesimini değerlendirerek tam derinlikte kürleme için gereken süreyi tahmin etmek için bir ilk deneme yapılması önerilir. Normal kürlenme süresi 5 ila 20 dakika arasında değişir.
PDMS replika kalıplama için, mikrometre ölçeğinde özelliklere sahip, temiz oda olanakları olmayan bir PDMS cihazının temiz imalatı zor olabilir: havadaki mikro parçacıklar, PDMS'nin yüksek oranda yapışkan yüzeyinde bulunabilir ve cihaz ile alt tabaka arasındaki sızdırmazlığı engelleyebilir veya tek tek mikro kanalların kesitini tıkayabilir. Protokol adımlarının laminer akış başlığı altında gerçekleştirilmesi ve PDMS yüzeyinin izopropanol ile tutarlı bir şekilde korunması, kontaminasyon risklerini önemli ölçüde en aza indirir. Kürlenme sıcaklığı ve süresi, PDMS çapraz bağlamayı ve ortaya çıkan fiziksel özellikleri doğrudan etkiler. Özellikle, kürlenmiş PDMS'nin yapışkanlığı kritik bir faktördür. Bir yandan, nöritlerin geçişini etkili bir şekilde kısıtlamak için PDMS cihazı ile nöronal hücre kültürü için kullanılan yüzey (örneğin, bir cam lamel veya bir MEA) arasında sıkı bir sızdırmazlık gereklidir. Öte yandan, PDMS cihazı, cihazı çıkardıktan sonra hassas yalıtım tabakası MEA'ların zarar görmemesi için yüzeye ters çevrilebilir şekilde yapışmalıdır. Kürleme sırasında PDMS büzülmesi meydana gelirken ve kalıbın önceden yeniden ölçeklendirilmesiyle düzeltilebilirken, burada belirtilen sıcaklıklar ve kürleme aralıkları için büzülme %2'den az olacaktır42 ve tek katmanlı PDMS cihazlarını önemli ölçüde etkilemeyecektir. Genel olarak, en iyi sonuçlar için önerilen kürleme sıcaklığı ve süresi değerlerini tam olarak takip edin.
Yöntemin avantajlarına ve sınırlamalarına genel bakış
Modüler sinir ağlarının deneysel çalışması için mikro ölçekli polimerik cihazların hızlı üretimi için 2-foton doğrudan lazer yazımına dayalı bir teknik önerilmiştir. Yumuşak fotolitografinin aksine, önerilen yaklaşım, işlevsel bir 2PP 3D baskı kurulumunun erişilebilir ve çalışır durumda olması koşuluyla, yüksek düzeyde teknik uzmanlık gerektirmez. Dikkat çekici bir şekilde, yöntem, CAD tarafından tasarlanmış bir 3D modelden tek bir gün içinde işlevsel bir PDMS cihazına geçmeyi sağlar, böylece konseptten somut gerçekleştirmeye doğrudan ve verimli bir yol sağlar. Spesifik olarak, kabuk ve iskele baskı modunu seçmek, hacminin yalnızca bir kısmı basıldığından, kalıbı oluşturmak için gereken süreyi önemli ölçüde azaltır. Basılı bileşenin müteakip UV ile kürlenmesi, burada PDMS ile 50'den fazla döküm döngüsünde doğrulandığı gibi, mekanik stabilitesini ve sağlamlığını garanti eder.
Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, 2PP 3D baskı, önemli bir en boy oranına, zorlu çözünürlük gereksinimlerine ve karmaşık üç boyutlu geometrilere sahip kalıpların imalatı söz konusu olduğunda en belirgin olan açık bir avantaja sahiptir. Standart UV litografi kullanılarak ana kalıpların üretimi, yaklaşık 200 μm'lik bir direnç kalınlığı ile sınırlandırılmıştır. Daha fazla yükseklik ve en-boy oranları elde etmek için karmaşık spin-kaplama ve pozlama döngüleri35, maliyetli LIGA (Litografi, Elektrokaplama ve Kalıplama) veya derin reaktif iyon aşındırma (DRIE) işlemleri36 gereklidir. Keskin bir tezat olarak, Kumi ve ark. 2010'da37, 2PP tekniği, basılı parçaların en boy oranı için mikrometre altından milimetreye kadar uzanan esasen sınırsız bir kapsam sunar. Burada, mikrokanalların yüksekliği (5 μm ve maksimum kalıbın yüksekliği (545 μm; bkz. Şekil 2) arasında 100 kattan fazla bir ayrım içeren, kısımlarının yüksekliğinde önemli bir fark olan bir kalıbın mikro üretim süreci örneklenmiştir.
Ayrıca, mikrometre altı çözünürlük, belirtilen protokol özellikleri izlenerek kolayca elde edilebilir. Buna karşılık, UV fotolitografi yoluyla gelişmiş kalıp çözünürlükleri elde etmek, sermaye yatırımı gerektirir. 600 nm nominal çözünürlükte kuvars üzerinde krom birikimi kullanan en iyi çözünürlüğe sahip maskeler, 250 μm35 çözünürlüğe sahip lazer baskılı baş üstü şeffaf maskelerden birkaç kat daha yüksek fiyatlandırılır, ancak Pirlo ve ark.41'in çalışmasına bakın. Kurum içi kullanım için uygun olması için, seçilen bir yöntemin uygun maliyetli olması gerekir. Birçok biyolojik laboratuvar için, geleneksel yumuşak fotolitografi veya doğrudan lazer yazımı ile ilişkili toplam masraf bir engel teşkil etmektedir. Temel bileşenleri satın alarak ve monte ederek her iki teknolojiyi de daha erişilebilir hale getirmek mümkün olsa da, bu yaklaşım ek uzmanlık gerektirir ve yine de kayda değer bir yatırım gerektirir. Bu bağlamda, dikkate alınması gereken önemli bir nokta, doğrudan lazer yazma yoluyla elde edilebilecek daha geniş uygulama yelpazesidir. Öncelikle kalıp mikro üretimi ile sınırlı olan geleneksel yumuşak fotolitografinin aksine, 2PP 3D baskı dikkate değer çok yönlülük sergiler. Potansiyel uygulamaları, mikroakışkanlar ve mikro-optiklerden entegre fotonik ve mikromekaniğe kadar uzanır. Bu, bu teknolojiye yatırım yapmayı, çoklu ve çeşitli bilimsel alanlar için ortak bir tesis olarak çekici hale getiriyor. Örneğin, bu protokolde geliştirilen 2PP tabanlı metodoloji, kurumumuz bünyesindeki nörobilim ve matematik bölümleri arasındaki disiplinler arası işbirliğinin bir sonucudur. Ek olarak, fotorezist geliştirme aktif bir araştırma alanıdır ve potansiyel olarak 2PP 3D baskı uygulama yelpazesini genişletebilir. Bunun bir örneği, IP-PDMS reçinesinin yakın zamanda piyasaya sürülmesidir. PDMS38 gibi özelliklere sahip yapılara polimerize olarak, bu reçine, kıvrımlı yüzeye sahip veya içi boş boşluklar içeren biyouyumlu bileşenlerin doğrudan mikrofabrikasyon potansiyelini ortaya çıkarır. Bu karmaşıklıklar, geleneksel replika kalıplama prosedürleri yoluyla benzer sonuçlar elde etmenin önündeki engeller olarak durmaktadır.
Bu yöntemin bir gösterimi olarak, modüler bir nöronal ağda iki modül arasında tek yönlü bağlantının geliştiğini gösteren kanıtlar sağlandı. 2PP tekniği ile üretilen mikro ölçekli kalıp, birden fazla PDMS dökümüne tabi tutulacak kadar dayanıklılığa sahipti ve gerekli mikro ölçekli hassasiyete sahipti. Sonuç olarak, bu çalışmada açıklanan protokolün uygulama kapsamı, gösterilen durumun ötesine uzanmaktadır. 2PP baskı teknolojisine erişim giderek yaygınlaştıkça, uygulanması için gereken ilk yatırım azalacak ve potansiyel uygulama yelpazesi genişleyecektir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
M.G., Avrupa İnovasyon Konseyi (IN-FET projesi, GA n. 862882, Arbor-IO projesi, FLAG-ERA ve İnsan Beyni Projesi, ID 650003) ve SISSA (Nörobilim Alanı) aracılığıyla Avrupa Birliği'nin H2020 Çerçeve Programı'ndan mali destek aldığını kabul etmektedir. GN, Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Matematik Alanı) hibesi yoluyla İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı'ndan (MUR) mali destek aldığını kabul etmektedir. 3D baskı, hücre kültürü ve canlı görüntüleme konusundaki yardımları için M. Gigante, B. Pastore ve M. Grandolfo'ya ve tartışmalar için Dr. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente ve H.C. Schultheiss'e teşekkür ederiz. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). -------------------------------------- Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
References
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J.
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
- Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
