Summary
Qui, descriviamo una piattaforma che consente l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati nella camera anteriore dell'occhio del topo. Il flusso di lavoro spazia dalla generazione di sferoidi da cellule epatiche primarie al trapianto nell'occhio di topo e all'imaging in vivo a risoluzione cellulare mediante microscopia confocale.
Abstract
Gli studi biomedici sul fegato nei mammiferi sono ostacolati dalla mancanza di metodi per l'imaging longitudinale non invasivo in vivo a risoluzione cellulare. Fino ad ora, l'imaging ottico del fegato in situ è possibile mediante imaging intravitale, che offre immagini ad alta risoluzione a livello cellulare ma non può essere eseguito più volte e, quindi, longitudinalmente nello stesso animale. I metodi di imaging non invasivi, come la bioluminescenza, consentono sessioni di imaging ripetute sullo stesso animale ma non raggiungono la risoluzione cellulare. Per colmare questa lacuna metodologica, abbiamo sviluppato una piattaforma per l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati nella camera anteriore dell'occhio del topo. Nel flusso di lavoro descritto in questo studio, gli sferoidi epatici primari di topo vengono generati in vitro e trapiantati nella camera anteriore dell'occhio dei topi riceventi, dove si innestano sull'iride. La cornea funge da finestra corporea naturale attraverso la quale possiamo visualizzare gli sferoidi trapiantati mediante microscopia confocale convenzionale. Gli sferoidi sopravvivono per mesi nell'occhio, durante i quali le cellule possono essere studiate in contesti di salute e malattia, oltre ad essere monitorate in risposta a diversi stimoli in ripetute sessioni di imaging utilizzando apposite sonde fluorescenti. In questo protocollo, forniamo una ripartizione dei passaggi necessari per implementare questo sistema di imaging e spieghiamo come sfruttarne al meglio il potenziale.
Introduction
Il monitoraggio della funzionalità epatica nei mammiferi durante la salute e la malattia è limitato dalla mancanza di tecniche di imaging in vivo ad alta risoluzione e non invasive. La visualizzazione di questo organo è ostacolata dalla sua posizione inaccessibile e, per ricostruire i processi cellulari, gli studi in vivo si basano sul sacrificio di animali in diversi punti temporali. Per aggirare questa limitazione dell'imaging, gran parte del lavoro si basa su modelli in vitro , in cui microtessuti simili al fegato vengono visualizzati e studiati in un ambiente controllato.
Negli ultimi anni, lo sviluppo di sistemi di coltura tridimensionali, come gli sferoidi epatici, ha aiutato e fatto progredire la ricerca sul fegato. Gli sferoidi epatici sono aggregati multicellulari che imitano in una certa misura il microambiente e le complesse interazioni cellula-cellula del tessuto epatico1 e offrono chiari vantaggi rispetto alle tradizionali colture monostrato 2,3. Gli sferoidi epatici sono anche usati come modelli per diverse malattie del fegato 4,5,6 e sono stati determinanti per comprendere i meccanismi della malattia. Tuttavia, i limiti chiave degli attuali modelli epatici in vitro sono la mancanza di un ambiente fisiologico in vivo e il tempo di utilizzo limitato in coltura (circa 20 giorni)3. Gli sferoidi epatici sono stati precedentemente trapiantati in diversi siti in vivo, come sotto la capsula renale7 o intraperitoneale8, che non sono accessibili per l'imaging ottico. L'imaging epatico intravitale è una tecnica all'avanguardia che offre imaging in tempo reale con risoluzione cellulare. Attualmente, questo imaging epatico in situ è possibile solo sull'organo esteriorizzato, che è altamente invasivo e spesso terminale9. Sebbene l'adattamento di una finestra addominale consenta ripetute sessioni di imaging epatico, comporta un intervento chirurgico complesso e cure post-operatorie.
Per eseguire il monitoraggio longitudinale a risoluzione cellulare, abbiamo esplorato il trapianto di sferoidi epatici nella camera anteriore dell'occhio (ACE) dei topi, dove il tessuto epatico è innestato in un ambiente fisiologico, collegato agli stimoli corporei e accessibile per l'imaging ottico. La cornea è un tessuto trasparente e funge da finestra attraverso la quale i microtessuti innestati sull'iride possono essere visualizzati in modo non invasivo e longitudinale mediante microscopia confocale. Qui, presentiamo un flusso di lavoro di questa piattaforma di nuova concezione per l'imaging in vivo di sferoidi epatici10. Questo protocollo è una guida passo passo per la sua implementazione, suddivisa in (1) l'estrazione di cellule epatiche primarie di topo e la formazione in vitro di sferoidi epatici, (2) il trapianto di sferoidi epatici nell'ACE di topi riceventi e (3) l'imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati in topi anestetizzati. Inoltre, mostreremo alcune delle possibilità e delle applicazioni di questa piattaforma di imaging.
Protocol
Tutte le procedure eseguite sugli animali sono state approvate dal Comitato etico per gli esperimenti sugli animali del Karolinska Institutet.
1. Estrazione di cellule epatiche primarie di topo e generazione di sferoidi epatici in vitro
- Preparazione
- Per l'incannulamento, la resezione epatica e l'isolamento delle cellule epatiche primarie, preparare i seguenti materiali sterili o monouso oltre alle pipette sierologiche e alle provette da centrifuga (Figura 1A): pompa peristaltica, centrifuga a secchiello oscillante, tampone assorbente, tappetino di dissezione, due pinze a punta curva, forbici chirurgiche, un ago a farfalla da 27 G, un filtro cellulare da 70 μm, un sollevatore cellulare, una piastra di Petri da 100 mm, camera di conteggio delle cellule e micropiastre a 96 pozzetti con fondo a U.
- Preparare le soluzioni utilizzate nella perfusione epatica, nell'isolamento delle cellule epatiche primarie e nella generazione di sferoidi epatici come elencato nella Tabella 1.
NOTA: Il tampone di digestione e la soluzione di gradiente devono essere preparati freschi. - Impostare il sistema di perfusione costituito da una pompa peristaltica, che conduce le soluzioni dal bagno d'acqua a 42 °C al fegato (Figura 1A). La temperatura più elevata del bagnomaria assicura che i tamponi raggiungano il fegato alla temperatura ottimale di 37 °C. Personalizzalo in base alla lunghezza del tubo e alla temperatura ambiente (RT).
- Per l'incannulamento, inserire un ago a farfalla da 27 G all'estremità del tubo. Mantenere il mezzo di placcatura utilizzato nelle fasi finali di isolamento a 4 °C.
- Procedimento
- Preriscaldare le seguenti soluzioni nel bagnomaria a 42 °C in provette da centrifuga da 50 mL: 40 mL di PBS, 20 mL di tampone di perfusione e 12 mL di tampone di digestione.
- Per pulire e riscaldare i tubi della pompa, far circolare circa 20 ml di PBS preriscaldato.
- Sostituire il tubo con il tampone di perfusione, adescare la provetta e l'ago a farfalla e impostare la portata a 4 ml/min. Assicurarsi che non vi siano bolle nel tubo durante le modifiche del buffer durante il protocollo.
- Sopprimere il topo mediante lussazione cervicale e utilizzare aghi per fissare gli arti alla tavola da dissezione.
- Bagnare il pelo dell'addome con etanolo al 70% e sezionarlo per accedere agli organi digestivi.
- Spostare l'intestino verso destra per esporre la vena porta e la vena cava inferiore (Figura 1B).
- Incannulare la vena cava a circa metà della sua lunghezza con l'ago in posizione orizzontale, assicurarsi che sia stabile e avviare la pompa.
- Quando il fegato inizia a gonfiarsi o compaiono punti bianchi nei lobi più vicini, tagliare la vena porta per consentire al sangue e al tampone di perfusione di defluire.
- Il fegato dovrebbe iniziare a sbollentare immediatamente. Incoraggiare la pulizia utilizzando una pinza curva per bloccare la vena porta a intervalli di 5 s.
- Ripetere il passaggio 1.2.9 fino a quando il fegato non è giallo e privo di sangue (circa 15-20 ml di tampone di perfusione).
- Arrestare la pompa peristaltica per sostituire il tubo con il tampone di digestione e riavviare la pompa. Quando il tampone di digestione raggiunge il fegato, ridurre la portata a 2,5 ml/min.
NOTA: Il rosso fenolo nel tampone di digestione consente di discriminare il suo arrivo al fegato e consente la regolazione dei parametri della pompa durante il trattamento. - Per incoraggiare il tampone a raggiungere tutti i lobi epatici e garantire una corretta digestione, ripetere più volte il passaggio 1.2.9.
- Interrompere il flusso della pompa peristaltica quando il tampone di digestione è esaurito o il fegato sembra sufficientemente digerito.
NOTA: Il grado di digestione può essere monitorato visivamente pizzicando delicatamente i lobi del fegato con una pinza e controllando se compaiono piccoli segni sul tessuto. Anche il fegato diventerà fragile. - Per estrarre il fegato, tagliare i legamenti epatici e le connessioni all'interno della cavità addominale, con l'obiettivo di rimuoverlo completamente, e metterlo nella capsula di Petri contenente 10 ml di terreno di placcatura a freddo (Tabella 1).
- Dopo aver rimosso la cistifellea, fai dei piccoli pizzichi sui lobi usando una pinza, strappando leggermente la capsula epatica. Scuotendo il fegato nel piatto, osserva le cellule che si riversano nel terreno.
- Tenendo fermo il fegato con una pinza, trascina delicatamente il sollevatore cellulare lungo i lobi per rilasciare le cellule.
NOTA: Una corretta digestione interlobulare porterà alla sospensione cellulare nel terreno, non a frammenti di tessuto. - Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere la sospensione cellulare dalla piastra di Petri e filtrarla attraverso il filtro cellulare da 70 μm posto su una provetta da centrifuga da 50 ml. Utilizzare un terreno di placcatura fresco per lavare il piatto di cellule epatiche digerite e trasferirle nel filtro.
- Centrifugare a 50 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare le cellule.
- Rimuovere il surnatante, lasciando circa 1 mL per coprire il pellet cellulare, agitare la provetta per risospendere le cellule, quindi aggiungere gradualmente 10 mL di terreno di placcatura a freddo.
- Aggiungere i 10 mL di soluzione a gradiente alla sospensione cellulare e capovolgere delicatamente la provetta 10 volte.
- Centrifugare a 200 x g per 10 min a 4 °C.
- Il pellet contiene cellule epatiche vitali arricchite per gli epatociti, mentre il surnatante contiene cellule morte e detriti. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica, lasciando circa 1 mL, e risospendere il pellet agitando delicatamente.
- Aggiungere 20 mL di terreno di placcatura a freddo alla sospensione cellulare e centrifugare a 50 x g per 5 minuti a 4 °C per lavare via la soluzione del gradiente.
- Rimuovere il surnatante, lasciando circa 1 mL sopra il pellet, e risospendere le cellule in 20 mL di terreno di placcatura a freddo.
NOTA: Qui il pellet cellulare può essere compattato, quindi, se necessario, utilizzare una pipetta sierologica da 10 ml per dissociare delicatamente le cellule. - Determinare manualmente il numero di cellule e la vitalità utilizzando una camera di conteggio delle cellule e Trypan Blue.
NOTA: Le cellule degli epatociti precipiteranno rapidamente nella provetta; Per risospenderli, capovolgere delicatamente il tubo alcune volte. - Seminare le cellule epatiche in 200 μL/pozzetto di terreno di placcatura a 1200 cellule/pozzetto in piastre a bassissima aderenza a 96 pozzetti.
NOTA: Il volume ottimale di terreno per pozzetto è di 200 μl; tuttavia, è possibile seminare le cellule in 100 μL/pozzetto. - Ruotare le piastre a 200 x g per 3 minuti per raccogliere le cellule al centro dei pozzetti.
- Incubare (37 °C, 5% CO2) le cellule e lasciarle formare sferoidi per 5 giorni (Figura 1C) in modo naturale.
- Il giorno 5, rimuovere con cura metà del terreno nel pozzetto e sostituirlo con un terreno di mantenimento privo di siero (Tabella 1). Ripetere questo passaggio ogni 48 ore fino al giorno 10, quando gli sferoidi epatici sono pronti per essere trapiantati.
NOTA: La formazione di una struttura simile a una capsula negli sferoidi epatici in coltura mostra una buona aggregazione e vitalità.
2. Trapianto di sferoidi epatici nella camera anteriore dell'occhio (ACE)
- Preparazione
- Per il trapianto di sferoidi epatici nell'ACE, assicurarsi di disporre le seguenti risorse (Figura 2A): stereomicroscopio, unità di anestesia con isoflurano, camera di induzione, isoflurano, termoforo, piastra di base in metallo su misura, supporto per la testa di topo e maschera antigas, pinza fissata al giunto cardanico solido, siringa a stantuffo filettata Hamilton da 500 μL, silicone, polietilene e tubo della pompa, cannula in vetro smussato su misura o catetere da 24 G, etanolo 70%, soluzione fisiologica sterile, aghi sterili da 23 G, unguento oculare (paraffina liquida e vaselina in rapporto 1:1), siringa monouso da 1 ml e piatto di sospensione cellulare da 35 mm.
- Pulire la siringa, il tubo e la cannula di Hamilton facendo passare etanolo al 70% e soluzione fisiologica.
- Riempire la siringa di Hamilton, il tubo e la cannula di vetro con soluzione fisiologica e fissare la siringa di Hamilton al banco in posizione orizzontale con del nastro adesivo (Figura 2A).
- Utilizzare una cannula di vetro smussato su misura.
- Allungare un capillare in vetro borosilicato utilizzando un estrattore per micropipette a doppio stadio fino a un diametro interno di >300 μm per consentire l'aspirazione degli sferoidi.
- Smussare e smussare la punta utilizzando uno smussatore a microelettrodi ed esporre la punta della cannula a una fiamma per alcuni secondi per ammorbidire i bordi.
NOTA: La smussatrice a microelettrodi è costituita da una pietra abrasiva rotante che viene azionata manualmente; pertanto, impostazioni specifiche non sono applicabili.
- In alternativa, costruire una cannula utilizzando la parte in plastica di un catetere da 24 G (Figura 2B).
- Preparare l'unità di isoflurano per anestesia e riscaldare il termoforo a 37 °C.
- Coprire le punte delle pinze attaccate al giunto cardanico solido con un pezzo di tubo di polietilene per formare un anello, che aiuta a stabilizzare l'occhio.
- Trasferire gli sferoidi epatici dalla piastra a 96 pozzetti in una piastra di sospensione cellulare da 35 mm con terreno di manutenzione utilizzando una pipetta e un puntale da 200 μl.
- Procedimento
- Anestetizzare il topo nella camera di induzione utilizzando una dose di isoflurano al 2,5% e 280 ml/min di aria.
- Quando il topo è incosciente, abbassare l'anestesia all'1,8% di isoflurano e 280 ml/min di aria, collegare il tubo per anestesia al supporto per la testa e trasferire rapidamente l'animale sul termoforo, posizionando il naso all'interno del supporto per la testa.
- Immobilizzare la testa con le viti, estrarre delicatamente l'occhiello dall'alveolo e fissarlo con la pinza e posizionare una goccia di soluzione fisiologica su entrambi gli occhi per evitare che si secchi.
- Sotto lo stereoscopio, utilizzare la siringa di Hamilton per aspirare e raccogliere gli sferoidi epatici nella punta della cannula e lasciarli riposare orizzontalmente su una superficie pulita.
NOTA: L'aspirazione dei terreni insieme agli sferoidi epatici aiuta a evitare che si attacchino alle pareti della cannula. - Perforare con cura la cornea utilizzando un ago da 23 G e asciugare l'umore acqueo filtrante con un fazzoletto. Se necessario, per allargare l'incisione, far scorrere con cautela l'ago lateralmente per tagliare la cornea.
NOTA: Per eseguire la puntura corneale viene utilizzato un ago sterile monouso, quindi la cornea non viene disinfettata prima dell'incisione. - Aggiungi gocce saline all'occhio per evitare che si secchi.
- Prendi la cannula contenente gli sferoidi epatici e tienila verticalmente per consentire agli sferoidi di gravitare verso la punta della cannula.
- Inserire delicatamente la cannula nel foro e, con lo smusso diretto verso la pupilla, utilizzare la siringa di Hamilton per espellere lentamente gli sferoidi epatici nell'ACE (Figura 2C).
NOTA: Prima di rimuovere la cannula, si consiglia di attendere alcuni secondi affinché le pressioni del liquido all'interno e all'esterno dell'occhio si riabituino ed evitino che gli sferoidi fuoriescano dall'occhio. - Dall'esterno della cornea, posizionare gli sferoidi epatici attorno alla pupilla e lontano dall'incisione pungolando delicatamente la cornea con la punta della cannula (Figura 2C).
- Attendere ~ 5-10 minuti affinché gli sferoidi del fegato si depositino sull'iride prima di rilasciare l'occhio dal forcipe.
- Applicare un unguento oculare alla vaselina sull'occhio operato, che aiuta a lubrificare e guarire la cornea.
- Se lo si desidera, procedere all'intervento sul secondo occhio seguendo lo stesso metodo.
- Prima di svegliare il topo, somministrare un analgesico per evitare fastidi post-operatori, ad esempio 0,1 mg/kg di buprenorfina in soluzione fisiologica sterile, somministrato per via sottocutanea.
NOTA: Ai topi è stata somministrata solo una dose di analgesici poiché si sono ripresi rapidamente da questa piccola procedura e non hanno mostrato alcun segno di dolore o comportamento alterato. Poiché questa procedura è molto rapida (richiede meno di 10 minuti) e provoca solo un lieve disagio, i topi non richiedono cure post-operatorie, a parte l'analgesia post-operatoria somministrata prima del risveglio dell'animale.
3. Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nell'ACE
- Preparazione
- Preparare i seguenti materiali e strumenti per l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati in ACE (Figura 3A): microscopio confocale verticale, obiettivo per immersione in acqua a lunga distanza di lavoro, unità per anestesia isoflurano, camera di induzione, isoflurano, termoforo, piastra di base metallica su misura, supporto per la testa di topo e maschera antigas, pinza attaccata all'articolazione universale solida, gel lacrimale artificiale, unguento per gli occhi (paraffina liquida e vaselina in rapporto 1:1).
- I materiali opzionali includono sonde fluorescenti iniettabili, siringhe monouso e aghi da 27 G per l'iniezione endovenosa della coda.
- Procedimento
- Anestetizzare il topo nella camera di induzione utilizzando una dose di isoflurano al 2,5% e 280 ml/min di aria.
- Quando il topo è incosciente, abbassare l'anestesia all'1,8% di isoflurano e 280 ml/min di aria, collegare il tubo per anestesia al supporto per la testa e trasferire rapidamente l'animale sul termoforo, posizionando il naso all'interno del supporto per la testa.
- Immobilizzare la testa nel portatesta utilizzando le viti.
- Metti una goccia di gel lacrimale artificiale su entrambi gli occhi per evitare che si secchino.
- A questo punto, iniettare per via endovenosa sonde fluorescenti attraverso la vena caudale e l'immagine subito dopo.
- Inclina la testa, estrai delicatamente l'occhio dall'orbita e fissalo con una pinza e in posizione sotto l'obiettivo.
- Applicare una generosa quantità di gel lacrimale artificiale per riempire lo spazio tra la cornea e l'obiettivo e concentrarsi sugli sferoidi epatici attraverso l'oculare.
NOTA: Se possibile, rimuovere l'oculare di uno degli oculari per ottenere una visione non ingrandita e individuare più facilmente gli sferoidi sull'iride. - Per ottenere immagini ad alta risoluzione nonostante i movimenti respiratori dell'animale, utilizzare obiettivi 25x e le seguenti impostazioni di imaging: formato 512 x 512 pixel, velocità di scansione di 600 Hz e uno spessore Z-stack di 3 μm. Vedere le impostazioni di imaging dettagliate nella Tabella 2.
NOTA: Durante l'imaging, la concentrazione di anestesia viene regolata da 1,6 a 2,2 mL/h di isoflurano per ottenere un ritmo respiratorio superficiale e controllato e quindi ridurre al minimo il movimento dell'animale. - Alla fine della sessione di imaging, trattare gli occhi ripresi con un unguento oculare alla vaselina prima di rimuovere l'isoflurano e risvegliare l'animale.
Representative Results
Le cellule epatiche primarie, arricchite per gli epatociti, sono state isolate dal fegato di topo mediante perfusione di collagenasi in due fasi, utilizzando una pompa peristaltica per far circolare tamponi caldi attraverso il fegato sfruttando la vascolarizzazione dell'organo per fornire enzimi di dissociazione a tutte le cellule (Figura 1A). Per questo, la vena cava inferiore è stata incannulata e la vena porta è stata tagliata per consentire il flusso dei tamponi (Figura 1B). In primo luogo, un tampone a base di HBSS è stato lavato attraverso il fegato per eliminare il sangue. Se l'incannulamento ha successo e non ci sono coaguli di sangue, il fegato sbianca e diventa giallo in pochi secondi. In secondo luogo, un tampone di digestione contenente la miscela di enzimi Liberase è stato fatto circolare attraverso il fegato per dissociare il tessuto in una sospensione unicellulare. Le cellule sono state contate manualmente e seminate in piastre a bassissima aderenza (ULA) a 96 pozzetti, che consentono l'autoassemblaggio in sferoidi in pochi giorni. Il giorno 5 si formano gli sferoidi e la sottile capsula che delimita gli sferoidi indica un'aggregazione riuscita (Figura 1C). Aspettiamo fino al giorno 10 per il trapianto, a quel punto gli sferoidi sono compatti e hanno sviluppato forti connessioni cellula-cellula. Il numero di cellule seminate per pozzetto ha determinato la dimensione dello sferoide epatico, con diametri di 1000, 1200 e 1500 cellule/pozzetto che producono sferoidi di 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm e 298 μm ± 19 μm (media ± SD), rispettivamente (Figura 1C, D). Per il trapianto, selezioniamo sferoidi di circa 250 μm di diametro per i seguenti motivi: (1) la dimensione degli sferoidi non deve essere troppo grande per evitare l'ipossia e il nucleo necrotico, ma deve contenere abbastanza cellule per supportare le comunicazioni cellula-cellula e per consentire il rimodellamento dell'innesto nell'occhio, (2) il peso degli sferoidi di queste dimensioni consente loro di gravitare verso l'iride e migliorare il loro attecchimento, (3) Questa dimensione è appropriata in relazione al trapianto di 5-10 sferoidi per occhio di topo.
L'intervento di trapianto richiede una siringa filettata manualmente collegata a una cannula di vetro (Figura 2A). La cannula di vetro è costituita da un capillare in vetro borosilicato modificato internamente per avere una punta smussata fine utilizzando un estrattore per micropipette e uno smussatore. È possibile creare una cannula alternativa più semplice utilizzando un catetere di plastica disponibile in commercio collegato al tubo della siringa e stabilizzato in un puntale per pipette (Figura 2B). L'intervento consiste nell'inoculazione di sferoidi epatici nell'ACE attraverso un'incisione nella cornea (Figura 2C). Gli sferoidi sono stati posizionati sui bordi della pupilla per renderli meglio accessibili per l'imaging ed evitare che si spostassero nell'angolo oculare. I topi albini sono stati utilizzati per il trapianto, poiché la loro iride non pigmentata consente l'imaging in vivo degli sferoidi epatici trapiantati. I topi riceventi sono stati trapiantati in entrambi gli occhi con 7-10 sferoidi/occhio e sono state scattate immagini stereoscopiche a 3 giorni dopo il trapianto (post-Tx) e a 1 settimana e 1 mese dopo la Tx per documentare la guarigione della cornea e il successo dell'attecchimento degli sferoidi (Figura 2D). Da notare, il cambiamento nell'aspetto degli sferoidi epatici nell'ACE tra il trapianto fresco e il completo innesto è dovuto all'insediamento dell'innesto sull'iride, nonché alla crescita di un monostrato di cellule dell'iride sopra lo sferoide. Il tasso di successo dell'attecchimento degli sferoidi epatici nell'ACE è del 70% (n = 9 occhi sia nei topi maschi che nelle femmine) (Figura 2E). I primi giorni post-Tx sono i più critici per la sopravvivenza e l'attecchimento, probabilmente a causa dell'animale ricevente che si strofina gli occhi e rimuove gli sferoidi prima che la cornea sia guarita. La dimensione degli sferoidi epatici non differisce significativamente dopo la Tx e i cambiamenti di forma sono attribuiti al rimodellamento e all'attecchimento dell'innesto (Figura 2F). A 1 mese dopo Tx, tutti gli sferoidi innestati presenti sull'iride sono stati vascolarizzati e innervati, come mostrato dalla colorazione in immunofluorescenza (Figura 2G).
L'imaging non invasivo in vivo viene eseguito su topi riceventi anestetizzati utilizzando un microscopio confocale verticale e un obiettivo a immersione a lunga distanza (Figura 3A, Tabella 2). L'imaging a fluorescenza nell'ACE può essere ottenuto attraverso diversi approcci, come illustrato nella Figura 3B. L'iniezione di sonde fluorescenti nella circolazione del topo ricevente consente la visualizzazione di diversi tipi di cellule e strutture all'interno degli sferoidi. Abbiamo usato la lectina per marcare i vasi sanguigni (Figura 3C), la CMFDA per osservare la rete dei canalicoli biliari (Figura 3D) e il pHrodo-LDL, che ha confermato l'assorbimento attivo di LDL nelle cellule sferoidi (Figura 3E). Possono essere utilizzati anche sferoidi epatici generati da modelli murini reporter. Gli sferoidi di Albumina-Cre:tdTomato hanno permesso la marcatura e il tracciamento degli epatociti (Figura 3F) e gli sferoidi che esprimono il biosensore Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) sono stati utilizzati per visualizzare le dinamiche del ciclo cellulare alla risoluzione di una singola cellula (Figura 3G). Infine, gli sferoidi epatici possono essere modificati geneticamente in vitro prima del trapianto e, nel caso della trasduzione del virus adeno-associato (AAV)-GFP, l'espressione è stata osservata in vivo per oltre 6 mesi (Figura 3H).
Figura 1: Isolamento degli epatociti primari di topo e generazione di sferoidi epatici. (A) Materiale e attrezzature utilizzati per l'isolamento degli epatociti primari di topo: 1. tamponi di isolamento; 2. Bagnomaria; 3. Pompa peristaltica; 4. Piastra di Petri; 5. Filtro cellulare; 6. Tampone assorbente; 7. Tappetino di dissezione; 8. Sollevatore cellulare; 9. Ago a farfalla 27 G; 10. Strumenti di dissezione. (B) Cavità addominale durante l'intervento chirurgico: la vena cava viene incannulata e perfusa e la vena porta viene tagliata per consentire il flusso dei tamponi. (C) Immagini in campo chiaro della formazione di sferoidi epatici in vitro a 0 (d0), 5 (d5) e 10 (d10) giorni dopo la semina, barre di scala = 200 μm. (D) Dimensioni degli sferoidi epatici a diverse concentrazioni di semina cellulare, n = 21 sferoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Trapianto e attecchimento di sferoidi epatici nell'ACE di topi. (A) Materiali e attrezzature utilizzati per il trapianto (Tx) di sferoidi epatici nell'ACE: 1. Sferoidi epatici in piastra di coltura; 2. Soluzione salina sterile; 3. Unguento per gli occhi; 4. aghi 23 g; 5. Cannula; 6. Siringa di Hamilton; 7. Tubo del gas per anestesia; 8. Portatesta e maschera antigas; 9. Termoforo; 10. Piastra di base in metallo su misura; 11. Pinza e giunto cardanico solido. (B) Configurazione della cannula e della siringa Hamilton: 1. Cannula di vetro collegata alla siringa Hamilton tramite tubo Portex e un ago da 27G; 2. La cannula di vetro è collegata al tubo Portex tramite segmenti aggiuntivi di tubi in silicone e tubi PharMed; 3. Cannula in plastica assemblata alternativamente; 4. Parti che formano la cannula di plastica: catetere in plastica 24G BD Insyte collegato tramite tubo PharMed e rivestito in un puntale per pipetta da 10 μl tagliato per stabilità e presa. (C) Illustrazione delle fasi della chirurgia Tx: 1. Gli sferoidi vengono raccolti nella cannula; 2. La cornea viene perforata con un ago; 3. La cannula viene inserita nell'incisione e gli sferoidi vengono rilasciati nell'ACE; 4. Dall'esterno dell'occhio, gli sferoidi sono posizionati vicino alla pupilla e lontano dall'incisione. (D) Immagini stereoscopiche di sferoidi epatici (sph) nell'occhio del topo il giorno dell'intervento e a 3, 7 e 30 giorni dopo la Tx. Le frecce indicano sferoidi vitali. (E) Tasso di attecchimento dello sferoide epatico (dimensione di 1200 cellule/pozzetto) post-Tx, n= 9 occhi in 6 topi riceventi. (F) Dimensione degli sferoidi epatici in coltura, prima del trapianto (in vitro, n= 20 sferoidi da singola preparazione) e a 1 mese dopo Tx nell'ACE (in vivo, n= 16 sferoidi in 3 topi riceventi), calcolata facendo la media dei diametri verticale e orizzontale. (G) Colorazione in immunofluorescenza di sferoidi epatici trapiantati a 2 mesi dopo Tx, che mostra vascolarizzazione (CD31, rosa, linea tratteggiata delinea la massa sferoidea) e innervazione simpatica (tirosina idrossilasi (TH), arancione), barra graduata = 100 μm. I dati per il pannello F sono stati adattati con il permesso di Lazzeri-Barcelo et al.10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging intraoculare non invasivo in vivo di sferoidi epatici trapiantati. (A) Materiale e attrezzature utilizzate per l'imaging ACE in vivo : 1. Microscopio confocale a scansione laser verticale; 2. Scatola scura; 3. Stadio XYZ motorizzato; 4. Obiettivo di immersione; 5. Portatesta e maschera antigas; 6. Pinza e giunto cardanico solido; 7. Termoforo; 8. Piastra di base in metallo su misura. (B) Diagramma che illustra i diversi approcci utilizzati per l'imaging in vivo di letture fluorescenti in sferoidi epatici trapiantati nell'occhio. (C-H) Immagini rappresentative di sferoidi epatici ACE durante l'imaging in vivo mediante microscopia confocale. Il segnale di retrodiffusione viene utilizzato per osservare il volume e la struttura dello sferoide; (C) Vasi sanguigni marcati mediante iniezione endovenosa di lectina fluorescente, barra graduata = 100 μm; (D) Rete di canalicoli biliari marcati mediante iniezione di CMFDA fluorescente, barra graduata = 50 μm; (E) captazione di LDL mediante iniezione di sonda fluorescente di pHrodo-LDL, barra graduata = 100 μm; (F) Epatociti che esprimono il pomodoro Td, punte di freccia indicano nuclei e asterischi indicano vascolarizzazione intrasferoidea, barra della scala = 50 μm; (G) Monitoraggio della dinamica del ciclo cellulare in sferoidi epatici che esprimono FUCCI, barre di scala = 50 μm (immagine principale) e 20 μm (blow-up). (H) sferoidi epatici trasdotti in vitro con AAV8-GFP prima di Tx e visualizzati nell'occhio a 6 mesi dopo Tx, barra della scala = 50 μm. L'immagine nel pannello G è stata adattata con il permesso di Lazzeri-Barcelo et al.10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Soluzioni utilizzate per l'isolamento degli epatociti primari di topo. Composizione delle soluzioni e dei tamponi necessari per l'isolamento degli epatociti di topo. I componenti del tampone di digestione e della soluzione gradiente devono essere miscelati freschi il giorno dell'isolamento. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2. Impostazioni del microscopio confocale Leica SP5 utilizzate per l'imaging intraoculare in vivo di sferoidi epatici. La tabella è stata adattata con il permesso di Lazzeri et al.10. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Discussion
Questo protocollo descrive una nuova piattaforma per l'imaging intraoculare in vivo di sferoidi epatici trapiantati nell'ACE. L'ACE è stato precedentemente utilizzato come sito di trapianto di altri microtessuti derivati da organi, come le isole pancreatiche11,12, grazie al suo microambiente di attecchimento unico, ricco di vasi, nervi e ossigeno, e all'accesso all'imaging attraverso la cornea. Mentre l'imaging epatico intravitale consente la visualizzazione di cellule e processi in situ, il monitoraggio longitudinale non è possibile. L'imaging del fegato attraverso una finestra addominale comporta un intervento chirurgico complesso e il movimento dell'organo all'interno del corpo rende difficile il monitoraggio di singole cellule nel tempo. Pertanto, questo nuovo metodo di imaging consente il monitoraggio longitudinale non invasivo delle cellule epatiche con risoluzione di una singola cellula.
Questo protocollo è diviso in tre parti. Il primo è l'isolamento degli epatociti primari tramite perfusione di collagenasi in due fasi, adattata da Charni-Natan et al.13, con la differenza che eseguiamo la perfusione epatica sul topo morto invece che sugli animali vivi anestetizzati. Questa variazione porta alcuni vantaggi, come meno considerazioni etiche e l'evitare residui di anestesia nell'organismo. In questo lavoro, generiamo sferoidi epatici dalla frazione arricchita di epatociti dell'isolamento, ma ciò non esclude la possibilità di isolare altre popolazioni cellulari non parenchimali utilizzando altri protocolli specializzati per produrre sferoidi di cocoltura di diversa composizione14,15.
La seconda parte di questo protocollo prevede il trapianto degli sferoidi epatici nell'ACE di topi riceventi. Si tratta di un intervento chirurgico rapido (meno di 10 minuti) e semplice eseguito su topi anestetizzati e non richiede alcun trattamento post-operatorio. La puntura della cornea si autosigilla e guarisce in 3-5 giorni. Occasionalmente, durante il processo di guarigione, si osserva un po' di nonnismo intorno all'incisione, ma questo si risolve entro pochi giorni. Non abbiamo avuto casi di sinechia anteriore negli occhi degli animali operati. Eseguiamo le procedure di trapianto in un laboratorio pulito ma all'aperto e senza problemi di infezioni agli occhi operati. L'inoculazione e l'attecchimento degli sferoidi nell'occhio non compromettono la vista né alterano il comportamento dell'animale ricevente. In questo protocollo, utilizziamo l'anestesia con isoflurano sia per la chirurgia dei trapianti che per l'imaging in vivo , che è ben tollerato nei topi. Grazie al suo effetto dose-dipendente, può essere facilmente regolato durante le procedure e porta il vantaggio di ridurre i tempi di sonno e risveglio. Tuttavia, è possibile utilizzare anestetici iniettabili alternativi. Dopo il trapianto, generalmente lasciamo 1 mese affinché gli sferoidi si attecchino completamente, si vascolarizzino e si innervano, prima di eseguire interventi di trattamento e imaging in vivo . Abbiamo anche dimostrato che il trapianto e l'attecchimento sono possibili utilizzando sferoidi epatici umani e topi riceventi immunocompromessi10.
La terza parte di questo metodo è l'imaging in vivo degli sferoidi epatici trapiantati nell'ACE. Questo protocollo descrive la configurazione di imaging in vivo , che utilizza apparecchiature di microscopia che si trovano comunemente nelle strutture di imaging di ricerca. Inoltre, i materiali specializzati, come il supporto per la testa del mouse e la cannula in plastica, sono ora disponibili in commercio. Con questa configurazione di imaging, siamo in grado di catturare sezioni z e ottenere una ricostruzione tridimensionale dell'architettura sferoide, a seconda della profondità di penetrazione del laser e del rilevamento della fluorescenza. Il monitoraggio della funzione cellulare negli sferoidi epatici trapiantati si basa sulla visualizzazione di proteine fluorescenti che riportano i tipi di cellule, le funzioni cellulari e le dinamiche. Pertanto, questa piattaforma di imaging può essere sfruttata utilizzando diverse modalità, da sole o in combinazione: (1) Le sonde fluorescenti possono essere somministrate per via endovenosa, ad esempio anticorpi per marcare e tracciare le cellule e coloranti funzionali; (2) Gli sferoidi epatici possono essere generati da cellule isolate da modelli murini reporter che esprimono proteine fluorescenti specifiche del fegato, ad esempio sferoidi epatici FUCCI che riportano la dinamica del ciclo cellulare; (3) La formazione di sferoidi epatici in vitro può essere combinata con la trasfezione o la trasduzione, per dotare gli sferoidi di proteine fluorescenti e biosensori. ad esempio, virus adeno-associati. Nelle nostre impostazioni sperimentali e utilizzando un singolo fotone per l'eccitazione, la profondità di imaging che è possibile ottenere è di circa 60-100 μm. Tuttavia, ciò dipende dalla potenza del laser e dalla disponibilità di imaging multifotone, dalle caratteristiche di emissione della sonda a fluorescenza e dalla sensibilità dei rivelatori, nonché dall'angolo dell'occhio in cui è innestato lo sferoide. Dopo l'acquisizione delle immagini, l'analisi delle immagini a valle può essere eseguita utilizzando programmi popolari come Image J e Imaris. Ad esempio, nel caso del reporter FUCCI, le cellule attive del ciclo cellulare in verde possono essere contate e confrontate con il numero di globuli rossi totali per valutare l'attività del ciclo cellulare all'interno dello sferoide trapiantato. Inoltre, la piattaforma di imaging ACE consente di applicare sostanze sull'occhio (sotto forma di collirio) o di iniettarle direttamente nell'ACE per trattare l'innesto e monitorarne la reazione. Post-mortem, gli sferoidi trapiantati possono essere facilmente recuperati mediante microdissezione manuale e possono fornire informazioni preziose con tecniche ex vivo , come la colorazione in immunofluorescenza, l'analisi trascrittomica, ecc.10.
Questa tecnica ha alcune limitazioni. Il primo è che, in base alla nostra esperienza, i topi riceventi devono essere albini, cioè avere l'iride non pigmentata. Dopo l'attecchimento, gli sferoidi epatici vengono ricoperti da un monostrato di cellule dell'iride, che non influisce sulla vitalità o sulla funzione degli sferoidi, ma il pigmento nelle cellule dell'iride impedisce l'imaging. Una seconda considerazione è la stabilità durante l'imaging intraoculare nei topi anestetizzati. Durante le sessioni di imaging in vivo , la concentrazione di anestesia e la respirazione dell'animale devono essere attentamente monitorate per ridurre al minimo i movimenti. Tuttavia, utilizzando le impostazioni di imaging qui indicate, siamo in grado di ottenere immagini ad alta risoluzione a livello di singola cellula.
Per riassumere, questo protocollo descrive l'implementazione di una piattaforma di imaging in vivo non invasiva di tessuto epatico innestato negli occhi dei topi. Utilizziamo procedure semplici, attrezzature comuni e materiali convenienti, rendendolo un approccio raggiungibile per molti ricercatori. Questo modello combina i vantaggi degli sferoidi epatici 3D in vitro con l'ambiente in vivo e l'accessibilità ottica forniti dall'ACE per creare una preziosa piattaforma per lo studio della fisiologia e della patologia epatica nella ricerca di base e in contesti preclinici.
Disclosures
P-OB è il cofondatore e CEO di Biocrine AB, IBL e BL sono consulenti di Biocrine AB.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Associazione svedese per il diabete, dai fondi del Karolinska Institutet, dal Consiglio svedese per la ricerca, dalla Fondazione Novo Nordisk, dalla Fondazione Family Erling-Persson, dal Programma di ricerca strategica sul diabete presso il Karolinska Institutet, dalla Fondazione Family Knut e Alice Wallenberg, dalla Fondazione Jonas & Christina af Jochnick, dall'Associazione svedese per la diabetologia e da ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. I disegni delle figure sono stati creati da FL-B utilizzando BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
| AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
| Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
| Absorbent pad | Attends | 203903 | |
| Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
| BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
| Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
| FBS | Gibco | N/A | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
| Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
| HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| Isoflurane | Baxter | N/A | |
| Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
| Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
| Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
| Oculentum simplex | APL | N/A | |
| PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
| PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
| PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
| pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
| Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
| Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
| Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
| Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
| Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
| Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
| Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
| Viscotears | Novartis | N/A | |
| William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |
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