Энзиматический пищеварения и ручной диссоциации: Метод подготовки C. elegans эмбрионов для клеточной культуры

Overview

Это видео вводит метод изоляции и стерильно культуры эмбриональных клеток C. elegans in vitro.

Protocol

1. Диссоциация эмбриональных клеток

1. Проведте следующие этапы процедуры в стерильных условиях с помощью ламинарного капюшона потока. Пока животные платье на плитах бактерий, моет и обработка с разрешением лиза содержа отбеливатель должна исключить большинств если не все бактерии. Таким образом, использование ламинарного капюшона в этот момент процедуры предотвращает новое загрязнение подвески яйца.
2. Resuspend гранулы яйца в 1 мл 2 мг / мл chitinase (запас в яичном буфере рН 6,5) и передать их в новую стерильную 15 мл конической трубки. Рок трубки в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Точное время инкубации изменяется в зависимости от свежести фермента и температуры помещения и поэтому должно быть определено для каждого препарата. Рекомендуется начать мониторинг яйцеклеток под перевернутым микроскопом клеточной культуры после 10 минут инкубации. Примечание: по нашему опыту, низкий рН увеличивает чичиназы энзиматической активности. По этой причине мы используем яичный буфер при рН 6,5 для растворения хитиназы (рецепт, о котором сообщалось выше, где рН регулируется до 6,5 с помощью NaOH).
3. Когда 80% яичной скорлупы переваривается путем лечения хитиназы(цифры 1 A-B), гранулы яйца центрифугации на 900 х г (2500 об / мин) в течение 3 мин. Используя пипетку P1000 и стерильные наконечники, тщательно удалите супернатант и добавьте 3 мл L-15 среды.
4. Перенесите яйца в пластину диаметром 6 см и аккуратно отмежевать клетки с помощью стерильного шприца 10 мл, оснащенного иглой 18 Г. Следите за степенью диссоциации, помещая каплю суспензии в свежую пластиковую чашку Петри и просматривая под микроскопом. Не аспирировать воздух в шприц во время этой процедуры, чтобы избежать повреждения клеток. Продолжайте диссоциацию до тех пор, пока 80% клеток не будут разобщены.
5. Фильтруйте подвеску с помощью стерильного фильтра Millipore 5 мкм. Подвески клеток должны быть отфильтрованы для того, чтобы удалить клеточные комки, непереваренные яйца и вылупившихся личинок. Фильтр дополнительные 4-5 мл свежих L-15 средств массовой информации через фильтр, чтобы восстановить все клетки. Не используйте чрезмерную силу во время фильтрации, чтобы избежать повреждения фильтра и/или ячеек.

2. Культивирование клеток

1. Пеллет диссоциированных клеток центрифугации при 900 х г (2500 об/мин) в течение 3 мин. Использование P1000 пипетки и стерильные советы тщательно удалить все supernatant. Resuspend гранулы клеток в полном L-15 средних и пластины 1 мл / хорошо. Количество добавленной среды зависит от количества использованных пластин 8P, слияния червей на пластинах и типа экспериментов, которые будут проводиться на клетках. Плотность клеток может быть определена с помощью гемоцитометра. Для записей патч-зажима оптимальна плотность покрытия в размере 230 000^{клеток/см 2.}
2. Держите 24 скважины пластины в пластиковый контейнер Tupperware, содержащий мокрые бумажные полотенца, чтобы избежать испарения культуры среды. Храните контейнер во влажном инкубаторе при температуре 20 градусов Цельсия и окружающем воздухе.
3. Клетки, как правило, готовы к экспериментам в течение 24 часов, когда морфологическая дифференциация и экспрессия маркеров GFP будут завершены. Клетки могут храниться в культуре до 2 недель, но они, как правило, наиболее здоровы до 7-9 дней после покрытия. Среда должна быть заменена один раз в день для поддержания здоровых клеток.

Representative Results

Рисунок 1. C. elegans эмбрионы до и после лечения хитиназы. (A) Фотография яиц до контакта с хитиназом. Стрелка указывает на прозрачную и неповрежденную яичную скорлупу, окружающую эмбрион. (B) Яйца, обработанные хитиназом в течение 10 мин. Яичная скорлупа переваривается и больше не видна вокруг эмбрионов. Стрелки указывают на трехкратные эмбрионы, выпущенные из яичной скорлупы. Синий ящик окружает группу ячеек, которые все еще прикреплены друг к другу.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator