Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

Summary

התולעת נמטודות למד באינטנסיביות<em> Caenorhabditis elegans</em> יכול להיות מהונדסים transgenically לבטא את הפפטיד האדם β עמילואיד (Aβ). ביטוי מושרה של Aβ ב<em> ג elegans</emשריר> מוביל פנוטיפ, שיתוק לשחזור מהיר שיכול לשמש כדי לפקח על טיפולים לווסת רעילות Aβ.

Abstract

הצטברות של הפפטיד β עמילואיד (Aβ) הוא האמין בדרך כלל להיות מרכזי הגיוס של מחלת אלצהיימר, אך המנגנון הרלוונטי (ים) של רעילות עדיין אינם ברורים. Aβ מופקד גם לתוך שריר ב שררת הכללה גוף, מיופתיה אדם חמורה. תולעת למד באינטנסיביות נמטודות Caenorhabditis elegans יכול להיות מהונדסים transgenically להביע Aβ האדם. בהתאם הרקמה או העיתוי של הביטוי Aβ, תולעים מהונדס יכול לקבל פנוטיפים מדידים בקלות המשמשים לקריאה מתוך רעילות Aβ. לדוגמה, תולעים מהונדס עם הביטוי הפאן העצבית Aβ יש פגמים היא למידה אסוציאטיבית (Dosanjh et al 2009.), בעוד תולעים מהונדס במבט המכונן שריר ספציפי להראות תלויי גיל מתקדם, שיתוק הפנוטיפ (קישור, 1995; כהן ואח' . 2006). אחת שימושית במיוחד C. elegans מודל מעסיקה מוטציה טמפרטורה רגיש במערכת מעקב mRNA מהנדס טמפרטורה ועין מתנהלת הביטוי שריר transgene Aβ, וכתוצאה מכך פנוטיפ שיתוק לשחזור על upshift טמפרטורה (Link et al. 2003). טיפולים נגד רעילות Aβ במודל זה [למשל, הביטוי של transgene מגן (חסן et al. 2009) או חשיפה תמציות גינקו בילובה (וו et al. 2006)] reproducibly לשנות את שיעור שיתוק הנגרם על ידי upshift הטמפרטורה של אלה מהונדס תולעים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שלנו למדידת שיעור השיתוק הזה ג מהונדס דגם אלגנס, עם תשומת לב מיוחדת משתנים ניסיוניים, כי זה יכול להשפיע על המדידה.

Protocol

1) הכנת צמיחה נמטודות צלחות מדיה עבור assay שיתוק. מבחני שיתוק מבוצעות על צמיחה תקן נמטודות מדיה (NGM) צלחות בשימוש שגרתי עבור ג elegans התפשטות וגנטיקה (Stiernagle, 2006). החיטוי הפתרון NGM המכילה NaCl, אגר ו Peptone בבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף את הכמויות המתאימות של CaCl 2 סטרילי, אורציל, כולסטרול, MgSO 1M 4 ו – 1M KPO 4. Aliquot 10 מ"ל של נוזל לתוך NGM מ"מ x 60 כל 15 מ"מ צלחת פטרי. אפשר NGM לחזק הלילה בטמפרטורת החדר. אם בדיקת ההשפעות של תרכובות / תמציות, aliquot תמצית על כל צלחת ולהשתמש מפזר כדי לפזר באופן שווה את תמצית על פני הצלחת. אפשר לחלץ לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. כרכים על מ"ל 1 ידרוש זמן רב יותר להתייבש. ספוט כל צלחת עם μL של 250 א ' coli OP5O זן גדל מדיה LB לילה עבור צפיפות אופטית של 0.4-0.6. אפשר חיידקים להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר. משתנים רלוונטיים הגיל של צלחות יש השפעה משמעותית על assay השיתוק, כמו צלחות מבוגרים יותר נוטים להתייבש. צלחות השתמש שפכו בתוך שבוע assay שיתוק. לקבלת תוצאות אידיאלי, לשפוך צלחות 3-4 ימים לפני תחילת אוכלוסיות תולעת סינכרוני [ראו (2) להלן]. לצורך ניסוי כלשהו, ​​להשתמש רק צלחות זרמו מן אצווה אותו. לשנות את הגודל של הדשא (כלומר הבחינו לעומת התפשטות) ו / או סוג של חיידקים גם לשנות את ההתנהגות של התולעים. מבחני שיתוק יכול להתבצע באמצעות חלופה א coli זנים כמקור מזון (למשל, זן HT115 בשימוש האכלה ניסויים RNAi), אבל זה יכול לשנות את קינטיקה של שיתוק, וכן הוא מחייב בקרה פנימית המתאימה. 2) הכנת גיל סינכרוני אוכלוסיות תולעת מסננים CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) אני; dvIs27 [Myo-3 / Aβ ​​minigene + רול-6 (su1006) גן סמן] X הוא הנפוץ ביותר עבור assaying Aβ-Induced שיתוק זה זן מהונדס דגמים אחרים זמינים. חוקרים אקדמיים תמורת סכום סמלי של גנטיקה Caenorhabditis מרכז (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). כדי למקסם את בתיאום הגיל של האוכלוסייה מבחן עדיף להתחיל עם דור ההורים מסונכרן. שבוע לפני שיזם את assay שיתוק של האוכלוסייה הבדיקה, השתמש בבורר תולעת פלטינה להעביר 20-30 מבוגרים הרה להולדת על 10 ס"מ צלחות כמה NGM התפשטות עם OP50 עבור ביצה 2 שעה שכב על 16 מעלות צלזיוס (טמפרטורת מתירני עבור CL4176 ). הסר את המבוגרים הרה להולדת צאצאים ולאפשר לגדול במשך 7 ימים, ועד אז הם יהיו "ביום השני" הרה להולדת מבוגרים. (יום 1) ומבוגרים היום השני הרה להולדת משמשים להכנת לגיל סינכרוני אוכלוסיות הבדיקה. עבור כל תנאי הניסוי המטרה היא ליצור צלחות בשלושה עותקים המכיל 50-75 גיל סינכרוני תולעים. באמצעות בורר תולעת פלטינה, העברת 10-12 של 2 מבוגרים יום הרה להולדת על 60 מ"מ (10 מ"ל נפח) צלחות NGM מנוקדות OP50. אפשר התולעים להטיל ביצים על 16 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ולאחר מכן לבחור את ומבוגרים ולאפשר הביצים לבקוע ולגדול ב 16 ° C. בשלב זה הוא הכי טוב שיש מישהו שלא יהיה הבקיע את הצלחות לקוד אותם, אז מלך השערים יהיה עיוור תנאי הניסוי. משתנים רלוונטיים שלב ההתפתחות העוברית כאשר הביצים מוטלות (~ שלב 26 תאים עבור סוג תולעים בר בתנאים אופטימליים) היא פונקציה של גיל תזונה למבוגרים. אם המבוגרים הרה להולדת משמש להכנת האוכלוסייה מבחן מבוגרים או רעב, ביצים בשלב מאוחר יותר יהיה מונח, הפחתת בתיאום הגיל של האוכלוסייה ואת שחזור של קינטיקה שיתוק. זה חיוני מאשר מונו axenic (כלומר, רק OP50 חיידקים) תרבויות משמשים (חיידקים מזהמים יכולים להשפיע קשות זה assay), וכן שחזור הוא הגבוה ביותר אם צלחות בשלושה עותקים יש מספר דומה של תולעים. 3) transgene אינדוקציה Assay שיתוק (יום 3) צלחות Upshift עד 25 ° C 48 שעות לאחר סיום הביצה סינכרוני להניח, תולעים צריך להיות בשלב הזחל השלישית (L3). פלטות צריכים להיות מסודרים בלי לערום ב 25 ° C בחממה כדי לאפשר צלחות כל להגיע 25 ° C באותו זמן. (יום 4) ניקוד בגין השיתוק של תולעים (זן CL4176) בשעה 18-20 שעות לאחר התחלת upshift. בשלב זה, את כל התולעים באוכלוסייה צריך הגיעו הזחל השלב הרביעי (L4). המשך הבקיע בשתי שעות במרווחים עד שכל תולעים על כל הצלחות משותקים. מסיבות שאינן ידועות, שיתוק אפילו לא על פני אורך הגוף: באזור הראש הוא החלק האחרון של התולעת להפסיק לזוז. לכן, worms כי יזמו לאחרונה שיתוק לא יכול לתרגם את פני הצלחת, אבל יכול להזיז את ראשם, ובכך לנקות חיידקים סביב הקדמי שלהם להשאיר "הילה" של חיידקים פינה. תולעים אלו יהיו תמיד להיות משותק לחלוטין, ולכן תולעים עם הילות מסווגים כמו משותק. תולעים מסוימות לא יהיו הילות אבל גם לא להראות תנועה ספונטנית; אלה נבחנים על ידי דרבון עם בורר את התולעת. אם תולעת דקר לא יכול לעבור התפשטות הגל גוף מלא על דרבון, הוא גם הבקיע כמו משותק. לקבלת ניקוד יעיל, זה הכי קל להעביר את התולעים משותק למגזר ללא רבב של הצלחת, כך שהם לא יהיו rescored במתכוון תקופת הניקוד הבא. (זה גם מאפשר אי – מסווג תולעים להפגין תנועה, מה שמאפשר תיקון ניקוד). כדי ליצור עקומת שיתוק, בכל נקודת זמן שבריר של תולעים על כל צלחת שלא היה משותק מומר אחוז, ואת ממוצע אחוז "unparalyzed" הוא זמם נגד הזמן מהופעת upshift. (הרציונל זממו בדרך זו הוא כי עקום וכתוצאה מקביל רשמית עקומת ההישרדות, וכך ניתן לנתח באמצעות תקן הלא פרמטרית סטטיסטיקות ההישרדות.) משתנים רלוונטיים Upshift של תולעים myo-3/Aβ מהונדס חייב להתרחש לפני שהם מגיעים לשלב אמצע L4 לשיתוק להיות יזם, כמו האמרגן-3 מיו מוסדר התפתחותי, צמצמה באופן משמעותי ביטוי מאוחר L4 או תולעים בוגרות. כמו כן, הביטוי של transgene זו חסומה אם תולעים להיות רעב, אז זה חיוני כי התולעים הם המדושנים במהלך הניסוי. אנחנו מעולם לא נצפתה תולעת משותק לשחזר בשום תנאי, ואחרי שעה של 12-16 upshift, כל CL4176 תולעים ישתקו, גם אם הם מורידה הילוך עד 16 ° C. ב זן CL4176, upregulation מספיק ביטוי transgene לגרום לשיתוק יכול להתרחש בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר, 20-25 ° C) למרות עיתוי שיתוק יהיה שונה. שיעור שיתוק תלוי זן מהונדס מסוים בשימוש (בנינו זנים myo-3/Aβ עם שני שיעורי מהר יותר לאט יותר מאשר CL4176), ולכן עם זנים החלופה חלון הניקוד ייתכן שיהיה צורך להתאים. 4) נציג תוצאות שמוצג באיור 1 היא מזימה של עקומת שיתוק עבור CL4176, הן טופלו וחשוף mM 6.27 קפאין (הריכוז הסופי בצלחת NGM). טיפול זה גורם עיכוב מאוד משמעותי מבחינה סטטיסטית שיתוק של כ 4 שעות, שבה אנו מפרשים מעיד כפי הדיכוי של רעילות Aβ במודל זה. שמוצג באיור 2 הוא ניסוי עצמאי assaying את ההשפעות של cafestol, אחרת נמצא מתחם קפה. העלילה זה אופייני עבור טיפולים שאינם השפעה רעילות Aβ. שים לב, בניסויים הן כמחצית מטופל CL4176 אוכלוסיות משותקים ב 24 שעות, ושיתוק תושלם על ידי 28 שעות. אלה הם זמנים אופייני שיתוק שליטה CL4176 אוכלוסיות. סטיות משמעותיות בין עיתוי זה מעיד על התנאים הסביבתיים שינו או מחיקה ספונטנית של עותקים transgene. (CL4176 מכיל מערך chromosomally משולבת מהונדס עם מספר עותקים של transgene myo-3/Aβ. למרות מערך מהונדס הוא בדרך כלל יציב למדי, כל הריבוי של זן בטמפרטורות> 16 ° C יבחר עבור תולעים נדיר כי עברו המחיקה ספונטנית של transgenes, וכתוצאה מכך וריאנטים כי יהיה מופחת הביטוי Aβ ותוצאות שיתוק איטי יותר.) באיור 1. עקומת שיתוק עבור זן CL4176 תולעים מטופל או חשופים לקפאין 6.27 מ"מ (Sigma). פעמים הם ציינו מן ייזום upshift הטמפרטורה. ברים שגיאה = SEM איור 2. עקומת שיתוק עבור CL4176 תולעים חשופים 0.48 mM cafestol (Sigma). ברים שגיאה = SEM

Discussion

פרוטוקול שתיארנו ניתן להשתמש ביעילות כדי assay את ההשפעות הרעילות של תרכובות על Aβ. פורסם דוגמאות כוללות את השפעת גינקו בילובה תמצית המרכיבים (וו et al. 2006) ו – רסרפין (אריה et al. 2009). תרכובות כי כבר מגן מפני רעילות Aβ במערכות אחרות יש גם הוכח להיות מגן במודל זה (למשל, ממנטין, התוצאות שלנו לא פורסם). הרציונל חשוב להקמת מודל זה היא כי מפותח כלים גנטיים ומולקולריים זמין ב C. elegans יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים של רעילות Aβ. לפיכך, השפעת מוטציות ספציפיות על רעילות Aβ ניתן assayed (למשל, את ההשפעה של הפחתת דמוי אינסולין איתות על ידי החדרת daf-2-הפסד של פונקציית מוטציה, Florez-מקלור et al. 2007), המודל הזה יכול גם ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות של מעל ביטוי transgenes (פונטה et al. 2008). עשינו לאחרונה שימוש נרחב במודל זה כדי לבחון את ההשפעות על הרעילות של יחיד החלפות חומצות אמינו Aβ (נתונים שלא פורסמו).

המודל המתואר כאן מהונדס מבחני ההשפעה של הביטוי Aβ חריפה על תפקוד תא שריר. בזמנו של שריר תאים שיתוק sarcomere שלהם הם שלמים; את הפנוטיפ שיתוק אינו תוצאה של מוות של תאים בשריר. עם זאת, לאחר שיתוק (~ 48 שעות לאחר upshift הראשונית) יש פירוט של שלמות השריר ועל המוות הסופי של התולעים. אנחנו לא בחנו את האפקט הזה במורד הביטוי Aβ או השתמשו בו כסמן רעילות.

Aβ ועין מתנהלת ביטוי המודל המתואר כאן אינו מתאים חוקרת טיפולים לווסת β עמילואיד היווצרות כשלעצמה. למרות תולעים מהונדס עם טופס ביטוי מכוננת Aβ פיקדונות עמילואיד לזיהוי בקלות (פיי et al 1998;.. Link et al 2001), תולעים מהונדס עם הביטוי Aβ ועין מתנהלת לעתים נדירות יש מרבצי העמילואיד ואת הפנוטיפ מופיע שיתוק עצמאית של בתצהיר עמילואיד (דרייק et al. 2003). תוצאות המחקר עולות בקנה אחד עם הדעה כי רעילות חריפה הנגרמת ביטוי בתוצאות Aβ מהצטברות של Aβ oligomeric מסיסים, לא בתצהיר עמילואיד.

Materials

Reagents	Quantity/2L	Company/Catalogue #	Comments
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Peptone	5g	Sigma-Aldrich / P0556
ddH2O	2L
1M CaCl2	2mL		147.02mg/mL in ddH2O
Uracil	2mL		2mg/mL in ddH2O
Cholesterol	2mL		5mg/mL in ethanol (do not autoclave)
1M MgSO4	2mL		246.5mg/mL in ddH2O
1M KPO4	50mL		98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH
Erlenmeyer Flask		VWR