El nematodo estudiado intensamente gusano<em> Caenorhabditis elegans</em> Puede ser transgénica para expresar lo humano β-amiloide (Aß). Indujo la expresión de Aß en<em> C. elegans</emMuscular> conduce a un fenotipo rápido, parálisis reproducible que puede ser usado para monitorear los tratamientos que modulan la toxicidad de Aß.
La acumulación del péptido β-amiloide (Aß) que generalmente se cree que ser central en la inducción de la enfermedad de Alzheimer, pero el mecanismo correspondiente (s) de toxicidad aún no están claros. Aß también se deposita por vía intramuscular en miositis cuerpos de inclusión, una miopatía grave en el hombre. El estudió intensamente nematodo Caenorhabditis elegans gusano puede ser transgénica para expresar Aß humanos. Dependiendo del tejido o momento de la expresión Aß, gusanos transgénicos pueden tener fenotipos fácilmente mensurables que sirven como una lectura de la toxicidad del Aß. Por ejemplo, los gusanos transgénicos con expresión Aß pan-neuronal tienen defectos es el aprendizaje asociativo (Dosanjh y otros, 2009.), Mientras que los gusanos transgénicos con los músculos específicos de expresión constitutiva muestran un progresivo, dependiente de la edad fenotipo parálisis (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Uno particularmente útil C. elegans modelo emplea una mutación sensible a la temperatura en el sistema de vigilancia de ARNm para el ingeniero de la temperatura muscular de expresión inducible de un transgén Aß, lo que resulta en un fenotipo parálisis reproducible en cambio ascendente de la temperatura (Link et al. 2003). Tratamientos que la toxicidad contra Aß en este modelo [por ejemplo, la expresión de un transgén de protección (Hassan et al. 2009) o la exposición a los extractos de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproducible alterar la tasa de parálisis muscular causada por cambios ascendentes temperaturas de estos transgénicos gusanos. A continuación se describe el protocolo para la medición de la tasa de parálisis en el C. transgénicos modelo elegans, con especial atención a las variables experimentales que pueden influir en esta medición.
El protocolo que hemos descrito puede ser utilizado con eficacia para analizar los efectos de los compuestos sobre la toxicidad de Aß. Ejemplos publicados incluyen los efectos de los componentes de extracto de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) y la reserpina (Arya et al. 2009). Compuestos que han sido de protección contra la toxicidad del Aß en otros sistemas también han demostrado tener un efecto protector en este modelo (por ejemplo, la memantina, nuestros resultados no publicados). Una razón importante para el establecimiento de este modelo es que las herramientas bien desarrolladas genéticos y moleculares disponibles en C. elegans pueden ser utilizados para investigar los mecanismos de toxicidad de Aß. Por lo tanto, las mutaciones de los efectos específicos sobre la toxicidad de Aß se puede probar (por ejemplo, el efecto de la reducción de la insulina como la señalización mediante la introducción de un daf-2 la pérdida de la función de la mutación, Florez-McClure et al. 2007), y este modelo también se puede se utiliza para examinar los efectos de los transgenes sobre-expresión (Fonte et al. 2008). Recientemente hemos hecho un amplio uso de este modelo para examinar los efectos sobre la toxicidad de una sola sustitución de aminoácido en Aß (datos no publicados).
El modelo transgénico se describe aquí el efecto de los ensayos de expresión Aß agudos sobre la función de las células musculares. En el momento de las células musculares y parálisis de sus sarcómeros están intactos, el fenotipo de la parálisis no es el resultado de la muerte de las células musculares. Sin embargo, después de la parálisis (~ 48 horas después del cambio ascendente inicial) se produce una ruptura de la integridad del músculo y la eventual muerte de los gusanos. No hemos investigado el efecto aguas abajo de expresión Aß o lo han utilizado como un marcador de toxicidad.
El modelo de expresión inducible Aß se describe aquí no es apropiado para la investigación de tratamientos que modulan la formación de β-amiloide en sí. Aunque los gusanos transgénicos con forma de expresión constitutiva depósitos de amiloide Aß fácilmente detectables (Fay et al, 1998;.. Link et al 2001), los gusanos transgénicos con expresión inducible Aß rara vez tienen los depósitos de amiloide y el fenotipo de la parálisis parece independiente de la deposición de amiloide (Drake et al. 2003). Nuestros resultados son consistentes con la opinión de que la toxicidad aguda inducida por los resultados de Aß expresión de la acumulación de Aß oligómeros solubles, no el depósito de amiloide.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Enlace que ayudó a desarrollar los protocolos descritos aquí, particularmente de Gin Fonte, quien desarrolló el procedimiento original. Este trabajo ha sido apoyado por los premios de la NIH (AG12423) y la Asociación de Alzheimer (Premio Zenith) para CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |