トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

Summary

激しく研究線虫<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em>は、トランスジェニックヒトβ-アミロイドペプチド（Aβ）を表現するように設計することができます。におけるAβの誘導発現<em> C.エレガンス</em>筋肉は、Aβ毒性を調節する治療法を監視するために使用することができる迅速な、再現性の麻痺の表現型につながる。

Abstract

β-アミロイドペプチド（Aβ）の蓄積は、一般的にアルツハイマー病の誘導の中心と考えられていますが、毒性の関連機構（s）はまだ明らかではないさ。 Aβは、封入体筋炎、深刻な人間の筋障害で筋肉内に堆積される。激しく研究線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、トランスジェニックヒトAβを発現するように設計することができます。 Aβ発現の組織やタイミングに応じて、トランスジェニックワームは、Aβ毒性の読み出しとして容易に測定可能な表現型を持つことができます。例えば、汎神経Aβの発現とトランスジェニックワームは、欠陥を持っている構成的筋肉特異的発現トランスジェニックワームはプログレッシブ、年齢依存性麻痺の表現型（リンク、1995年を表示しながら、連想学習（Dosanjh ら2009。）であり、Cohen ら2006年）。特に有用なC.エレガンスモデルは、温度上昇（リンクら、2003）によって再現性の麻痺の表現型で、その結果、Aβ遺伝子の温度によって誘発された筋の表現を設計するためのmRNAサーベイランスシステムの温度感受性変異を採用しています。このモデルのカウンタAβ毒性[例えば、保護遺伝子（ハッサンら 2009）やイチョウ葉抽出物への曝露の発現（Wu ら 2006）]再現性これらのトランスジェニックの温度上昇によって誘発される麻痺の速度を変更することが治療法ワーム。ここでは、このトランスジェニックCに麻痺の速度を測定するため、我々のプロトコルを記述するこの測定に影響を与えることができる実験的な変数に特に注意を払って虫モデル 、。

Protocol

1）麻痺のアッセイのために線虫の増殖培地のプレートを準備。 麻痺のアッセイは、日常的にCのために使用される標準的な線虫の成長メディア（NGM）プレート上で実行されます線虫伝播と遺伝学（Stiernagle、2006）。 三角フラスコ中のNaCl、寒天とペプトンを含むNGMソリューションをオートクレーブし、無菌のCaCl 2、ウラシル、コレステロール、1M MgSO 4で1M KPO 4の適切な量を追加します。各60ミリメートル× 15ミリメートルシャーレに液体NGMの一定分量を10mL。 NGMは、室温で一晩固化することができます。 化合物/抽出物の効果のためのテストの場合、分注し、各プレート上に抽出し、均一にプレートの表面上に抽出液を配布するために、スプレッダを使用してください。室温で一晩乾燥させて抽出することができます。 1 mLの上のボリュームは、乾燥に時間がかかります。 E.の250μLで各プレートを見つける大腸菌株のOP5Oは0.4〜0.6の光学密度のため一晩LB培地で増殖させた。細菌は室温で一晩乾燥することができます。 関連する変数古い板が乾燥する傾向があるので、プレートの年齢は、麻痺の検定に大きな影響を及ぼす場合がある。麻痺アッセイの一週間以内に注がプレートを使用してください。理想的な結果を得るためには、同期ワーム集団の開始前に3-4日は、[（2）を参照してください]プレートを注ぐ。どんな実験では、同じバッチから注がプレートをのみを使​​用してください。 芝生のサイズ（すなわち斑点対スプレッド）及び/または細菌の種類を変更すると、またワームの動作を変更します。麻痺のアッセイは別のEを使用して行うことができます。 大腸菌の食料源（例えば、RNAi実験を餌に使用されるHT115歪み）などの系統が、これは、このように、適切な内部統制を必要とする、麻痺の速度を変更することができます。 年齢同期ワームの個体群の2）の調製ひずみCL4176（SMG – 1（cc546 TS）I; dvIs27 [ミオ- 3 /はAβミニジーン+ ROL – 6（su1006）マーカー遺伝子] Xは、最も一般的にAβ誘発性麻痺をアッセイするために使用され、この菌株と他のトランスジェニックモデルが利用可能である。 線虫遺伝学センター （http://www.cbs.umn.edu/CGC/）からわずかな料金で学術研究者に。 テストの人口の年齢の同期を最大化するためには、同期された親世代から始めるのが好ましい。週間前には、試験集団の麻痺アッセイを開始、16歳でレイアウト2時間の卵のためOP50で広がる数十cmのNGMプレート上に20〜30妊娠成人を転送するためにプラチナのワームピッカーを使用して° C（CL4176のための許容温度）。妊娠成人を削除し、子孫がその時点で彼らは妊娠成人"二日目"となる、7日間に成長することができます。 （1日目）二日目の妊娠大人の年齢同期テストの集団を調製するのに使用されています。各実験条件の場合、オブジェクトが50〜75歳同期ワームを含む三連のプレートを生成することです。プラチナのワームピッカーを使用して、60ミリ（10 mLの体積）OP50をスポットしたNGMプレート上に2日目妊娠成人の10-12を転送する。ワームはその後、大人を狙い撃ちし、卵が孵化することができますし、16で成長し、2時間16℃で産卵のために℃に許可するこの時点ではそれらをコーディングするためにプレートをスコアリングされることはありません誰かを持っていることが最善である、得点王は、実験条件に盲目になるように。 関連する変数卵が配置されている胚発生の段階（最適な条件の下で野生型のワームのための〜26細胞期）は、成人年齢と栄養の関数です。試験集団の調製に使用される妊娠大人が古いまたは飢餓の場合は、後の段階の卵は、人口の年齢の同調性と麻痺の動態の再現性を減らす、レイアウトされます。それは（微生物汚染が深刻なこのアッセイに影響を与えることができる）が使用されているモノ – 無菌（すなわち、のみOP50細菌）の培養より本質的なさ、そして三重のプレートは、ワームの似たような数字を持っている場合、再現性は最高です。 3）導入遺伝子の誘導と麻痺アッセイ （3日目）25〜アップシフトプレート℃で48時間同期卵の産卵終了後、ワームは、サード幼虫（L3）になっているはず。プレートは、全てのプレートが同時に25℃に達するように25℃インキュベーターでスタッキングすることなく配置する必要があります。 （4日目）シフトアップの開始後18〜20時間でワーム（株CL4176）の麻痺の得点を開始します。この時点で、人口のすべてのワームは第幼虫（L4）の段階に達している必要があります。プレートの各上のすべてのワームが麻痺しているまでは2時間単位でスコアリングを続ける。理由は不明であるが、麻痺があっても、人体の長さを越えていないです：頭部は移動停止するワームの最後の部分です。このように、W最近麻痺を開始したORMはプレートを介して変換することはできませんが、それによって彼らの前方周囲に細菌をクリアし、クリアバクテリアの"ハロー"を残し、彼らの頭を移動することができます。これらのワームは、常に完全に麻痺になるので、ハローを持つワームが麻痺したように分類されます。いくつかのワームは、ハローを持ってされませんが、また自発的な動きが表示されません。これらは、ワームのピッカーでつついによってテストされています。採用を働きかけワームがつついによって全身の波動伝播を受けることができない場合、それはまた、麻痺スコアされる。効率的なスコアリングに、それは彼らが意図せずに次の得点の期間をrescoredされないようにプレートの気づかれていないセクタに麻痺ワームを移動するのが最も簡単です。 （これは、スコアリング補正が可能、誤分類されたワームの動きを実証することができます）。 麻痺の曲線を生成するには、各時点で麻痺されていない各プレート上でワームの割合がパーセンテージに変換され、平均的な"unparalyzed"割合は、シフトアップ開始からの時間に対してプロットされる。 （この方法でプロットするための理論的根拠は、結果の曲線は生存曲線に正式に類似しているため、標準的なノンパラメトリックな生存の統計を使用して分析できることです。） 関連する変数彼らはミオ- 3プロモーターが的に調節されると、開始する、と大幅に遅れてL4または成虫で発現を減少している麻痺のために半ばL4段階に達する前に、トランスジェニックmyo-3/Aβのワームのシフトアップが発生する必要があります。同様に、この導入遺伝子の発現がブロックされているワームが飢餓になれば、それはワームが実験全体を通して十分に供給されることが不可欠ですので。彼らは16℃にシフトダウンされている場合でも、我々はいかなる条件の下で回復するために麻痺ワームを観察したことがない、とシフトアップの12から16時間後、すべてのCL4176ワームが麻痺されます。ひずみCL4176で、導入遺伝子発現の十分なアップレギュレーションは、麻痺のタイミングが変更されますが麻痺（すなわち、20〜25℃）より低い温度で発生する可能性が生じるため。麻痺率が使用される特定のトランスジェニック系統（我々はCL4176より速く、遅い速度の両方でmyo-3/Aβ株を構築している）に依存するので、別の系統でスコアウィンドウは調整する必要があります。 4）代表者の結果図1に示すように未処理とカフェイン6.27 mMの（NGMプレートに終濃度）に暴露された両方CL4176のための麻痺の曲線のプロットである。この治療法を我々はこのモデルでAβ毒性の抑制のような指標と解釈する約4時間、の麻痺の高度に統計的に有意な遅延の結果。図2に示すようにカフェストール、コーヒーに見られる別の化合物の効果を測定する独立した実験です。このプロットは、Aβ毒性に影響を与えない治療法が一般的です。両方の実験では約半分の未処理CL4176集団が24時間で麻痺し、麻痺が28時間で完了していることに注意してください。これらは、コントロールCL4176集団の麻痺の典型的な時間枠です。このタイミングから大きく逸脱は、変化した環境条件や導入遺伝子のコピーの自発的削除を示すものである。 （CL4176はmyo-3/Aβ導入遺伝子の複数コピーを持つ染色体に組み込まれたトランスジェニック配列を含んでいる。このトランスジェニック配列は通常、非常に安定していますが、高温でのひずみの任意の伝播は、> 16 ° Cで受けた珍しいワームのために選択されますAβ発現と遅い麻痺の結果を減らしているだろう変種で、その結果導入遺伝子の自発的削除、。） 図1。未処理または6.27 mMのカフェイン（シグマ）にさらされた菌株CL4176ワームの麻痺の曲線。指示された時間は、温度上昇の開始から取得しています。エラーバーは= SEM 図2。 0.48 mMのカフェストール（シグマ）にさらされるCL4176ワームの麻痺のカーブ。エラーバーは= SEM

Discussion

私たちが説明しているプロトコルは効果的にアッセイAβ毒性に対する化合物の影響をするために使用することができます。公開された例では、イチョウ葉エキスの成分（Wu ら、2006）とレセルピン（アーヤら 2009）の効果が含まれています。他のシステムにおけるAβ毒性に対する保護されている化合物はまた、（例えば、メマンチン、私たちの未発表結果）このモデルでは、保護であることが示されている。このモデルを確立するための重要な根拠は、Cでそのよく発達した遺伝子や分子のツールが利用可能です。 エレガンスは、Aβ毒性のメカニズムを調べるために使用することができます。従って、Aβ毒性への影響の特定の変異が分析することができる（例えば、インスリン様DAF – 2の機能喪失変異が、フローレス-マクルーアらを導入することによってシグナル伝達を低減させる効果。2007）、そしてこのモデルこともできます過剰発現トランスジーン（フォンテら 2008）の効果を調べるために使用される。我々は最近、Aβの単一のアミノ酸置換（未発表データ）の毒性への影響を調べるためにこのモデルを広範囲に使用してきた。

トランスジェニックモデルはここにアッセイの筋細胞機能に対する急性Aβ発現の効果を説明した。麻痺の筋細胞とそれらのサルコメアの時にそのまま残っています。麻痺の表現型は、筋肉の細胞死の結果ではない。しかし、麻痺した後（初期シフトアップ後〜48時間）筋肉の整合性やワームの最終的な死の内訳があります。我々はAβ発現のこの下流に及ぼす影響を検討または毒性のマーカーとしてそれを使用していない。

ここで説明した誘導Aβ発現のモデルはそれ自体がβ-アミロイドの形成を調節治療を調査するための適切ではありません。構成的Aβの表現形式容易に検出可能なアミロイドの沈着によるトランスジェニックワームが（フェイら1998;。。リンクら 2001）、誘導Aβの発現とトランスジェニックのワームはほとんどのアミロイド沈着がなく、麻痺の表現型は、アミロイドの沈着（ドレイクらの独立が表示されます。 2003年）。我々の結果は、可溶性オリゴマーAβの蓄積から誘導Aβの発現の結果のビューその急性毒性ではなく、アミロイドの沈着と一致している。

Materials

Reagents	Quantity/2L	Company/Catalogue #	Comments
NaCl	6g	Sigma-Aldrich / S9888
Agar	40g	Sigma-Aldrich / A7002
Peptone	5g	Sigma-Aldrich / P0556
ddH2O	2L
1M CaCl2	2mL		147.02mg/mL in ddH2O
Uracil	2mL		2mg/mL in ddH2O
Cholesterol	2mL		5mg/mL in ethanol (do not autoclave)
1M MgSO4	2mL		246.5mg/mL in ddH2O
1M KPO4	50mL		98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH
Erlenmeyer Flask		VWR