O verme nematóide intensamente estudada<em> Caenorhabditis elegans</em> Pode ser transgenicamente projetadas para expressar o peptídeo β-amilóide humana (Aâ). Expressão induzida de Aâ em<em> C. elegans</emMuscular> leva a uma rápida paralisia fenótipo, reproduzível que pode ser usado para monitorar tratamentos que modulam a toxicidade Aâ.
Acúmulo do peptídeo β-amilóide (Aâ) é acreditado geralmente para ser central para a indução da doença de Alzheimer, mas o mecanismo relevante (s) de toxicidade ainda não estão claros. Aâ também é depositado por via intramuscular em Miosite Inclusão Corpo, uma miopatia severa humana. A intensamente estudada nemátodo Caenorhabditis elegans worm pode ser projetado para expressar transgenicamente Aâ humana. Dependendo do tecido ou o momento de expressão Aâ, worms transgênicos podem ter fenótipos facilmente mensuráveis, que servem como uma leitura de toxicidade Aâ. Por exemplo, worms transgênicos com pan-neuronal expressão Aâ têm defeitos é aprendizagem associativa (Dosanjh et al 2009.), Enquanto worms transgênicos com constitutiva músculo-específicos expressão mostram uma progressiva, dependente da idade fenótipo paralisia (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Um C. particularmente útil elegans modelo emprega uma mutação sensível à temperatura no sistema de vigilância mRNA para engenheiro de temperatura induzida por expressão de um transgene muscular Aâ, resultando em um fenótipo paralisia reprodutíveis sobre upshift temperatura (Link et al. 2003). Tratamentos que a toxicidade Aâ contra neste modelo [por exemplo, a expressão de um transgene de proteção (Hassan et al. 2009) ou exposição a extratos de Ginkgo biloba (Wu et al. 2006)] reproducibly alterar a taxa de paralisia induzida por upshift temperatura desses transgênicos worms. Aqui nós descrevemos nosso protocolo para medir a taxa de paralisia neste C. transgênicos elegans modelo, com particular atenção às variáveis experimentais que podem influenciar esta medida.
O protocolo que temos descrito pode ser efetivamente usado para ensaio dos efeitos de compostos de toxicidade Aâ. Exemplos publicados incluem os efeitos dos constituintes Ginkgo biloba (Wu et al. 2006) e reserpina (Arya et al. 2009). Compostos que têm sido de proteção contra a toxicidade Aâ em outros sistemas também foram mostrados para ser protetor neste modelo (por exemplo, a memantina, nossos resultados não publicados). Uma lógica importante para o estabelecimento deste modelo é que as ferramentas bem desenvolvidas genética e molecular disponíveis em C. elegans pode ser usado para investigar os mecanismos de toxicidade Aâ. Assim, as mutações efeitos específicos sobre a toxicidade Aâ puderem ser analisadas (por exemplo, o efeito de reduzir insulin-like de sinalização através da introdução de uma daf-2 mutação de perda de função, Florez-McClure et al. 2007), e este modelo também pode ser usado para examinar os efeitos da sobre-expressão transgenes (Fonte et al. 2008). Recentemente, fez uso extensivo desse modelo para examinar os efeitos sobre a toxicidade de uma única substituições de aminoácidos na Aâ (dados não publicados).
O modelo aqui descrito transgênicos ensaios o efeito de expressão Aâ aguda sobre a função das células musculares. No momento de células paralisia muscular e seus sarcômero estão intactos; o fenótipo paralisia não é o resultado de morte celular do músculo. No entanto, após a paralisia (~ 48 hr após upshift inicial) há uma ruptura da integridade muscular e eventual morte dos vermes. Nós não investigamos o efeito a jusante de expressão Aâ ou usado como um marcador de toxicidade.
O modelo de expressão induzível Aâ descrito aqui não é apropriado para a investigação de tratamentos que modulam a β-amilóide formação de per se. Embora vermes transgênicos com forma constitutiva Aâ expressão depósitos de amilóide facilmente detectável (Fay et al 1998;.. Ligação et al 2001), worms transgênicos com a expressão induzível Aâ raramente têm depósitos de amilóide eo fenótipo paralisia aparece independente de amilóide (Drake et al. 2003). Nossos resultados são consistentes com a visão de que a toxicidade aguda de resultados Aâ induzida expressão da acumulação de Aâ oligomérico solúvel, não amilóide.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer aos membros atuais e antigos do laboratório de ligação que ajudou a desenvolver os protocolos aqui descritos, particularmente Gin Fonte, que desenvolveu o procedimento original. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (AG12423) e Associação de Alzheimer (Prêmio Zenith) para CDL
Reagents | Quantity/2L | Company/Catalogue # | Comments |
NaCl | 6g | Sigma-Aldrich / S9888 | |
Agar | 40g | Sigma-Aldrich / A7002 | |
Peptone | 5g | Sigma-Aldrich / P0556 | |
ddH2O | 2L | ||
1M CaCl2 | 2mL | 147.02mg/mL in ddH2O | |
Uracil | 2mL | 2mg/mL in ddH2O | |
Cholesterol | 2mL | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | |
1M MgSO4 | 2mL | 246.5mg/mL in ddH2O | |
1M KPO4 | 50mL | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | |
Erlenmeyer Flask | VWR |