Summary
Drosophila melanogaster testicules peuvent être rapidement et efficacement isolées des mâles adultes utilisant des aiguilles à dissection. Avec la pratique, on peut facilement isoler dans un ou deux jours d'un montant de testicules suffisant pour l'analyse d'ADN ou d'ARN par séquençage à haut débit ou plus des méthodes traditionnelles de biologie moléculaire ou de protéines pour des dosages d'anticorps ou à base d'enzymes.
Abstract
Les testicules de Drosophila melanogaster fournissent un modèle important pour l'étude de la maintenance des cellules souches et la différenciation, la méiose, et soma-germinale interactions. Les testicules sont généralement isolées des mâles adultes 0-3 jours après l'éclosion de la coque de nymphose. Les testicules des mouches de type sauvage sont facilement distingués des autres tissus, car ils sont jaunes, mais les testicules de blanc mouches mutantes, un fond génétique commun des expériences en laboratoire sont similaires dans les deux formes et couleurs à l'intestin voler. Effectuer une dissection sur une lame de microscope en verre avec un fond noir rend l'identification des testicules considérablement plus facile. Les testicules sont retirés de la mouche à l'aide d'aiguilles de dissection. Comparé à des protocoles qui utilisent des pinces pour la dissection des testicules, notre méthode est beaucoup plus rapide, permettant à un individu bien pratiqué la dissection des testicules de 200 à 300 de type sauvage mouches par heure, ce qui donne 400-600 testicules. Testicules de mouches blanches ou de mutants qui réduisent la taille des testicules sont plus difficiles à disséquer et généralement le rendement de 200 à 400 testicules par heure.
Protocol
- Faire une lame de microscope en verre avec un fond noir: Couper papier 20 # blanc à la même taille que la lame du microscope. Couleur d'un côté du papier noir glisser-taille à l'aide d'un marqueur permanent (par exemple, Sharpie). Appliquez la colle blanche (Elmer) pour le côté noir et faire adhérer le papier à la diapositive. La lame peut être réutilisé. Utiliser ¾ "ruban d'étiquettes (Fisherbrand), sécuriser la lame de microscope, côté verre en place, au pad volée CO 2 pour le fixer en place.
- Recueillir 0-3 jours mouches vieux mâle.
- Préparer un seau de glace, un tampon phosphate salin (PBS), aiguilles à dissection.
- Anesthésier 50-100 mouches en utilisant un flux de CO 2 et de les transférer de la bouteille ou le flacon au pad volent près de la lame de microscope.
- Pipeter ~ 50 ul PBS glacé dans une chute au milieu de la lame de microscope.
- Doucement ramasser une mouche mâle avec la dissection d'aiguille par immersion de l'aiguille de dissection dans du PBS, toucher doux du côté ventral (par exemple, près des ailes) de la mouche avec l'aiguille qu'il place dans la goutte de PBS.
- Placer une aiguille sur le milieu de la volée, entre le thorax et l'abdomen, en appuyant fermement. Placer l'autre aiguille entre la sixième (A6) et septième (A7) segments abdominaux (les rayures deuxième et troisième à partir du bas), puis tirer l'abdomen loin du thorax.
- Taquiner les testicules à part d'autres organes, en particulier l'intestin. Surtout dans des mutants de blanc, les testicules et l'intestin se ressemblent. Les principales différences sont que les testicules viennent toujours par paire, chaque testicule est un motif en spirale et est plus blanche que les intestins.
- Stocker les testicules dans PBS glacé dans un tube à centrifuger en polypropylène.
Les résultats représentatifs:
Figure 1. Vue dorsale du système reproducteur masculin, à partir de flybase.org/reports/FBim0000074.html. FlyBase attribution:... "Après la figure 38 A à la page 508 de Miller (1950) A. Miller L'anatomie interne et de l'histologie de l'imago de Drosophila melanogaster, dans M. Demerec, rédacteur en chef, biologie de la drosophile, chapitre 6, pages 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, édition fac-similé, 1994. Copyright 1994 par le Cold Spring Harbor Laboratory Press. Utilisé avec l'aimable autorisation de Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) de presse. Voir http://www.cshlpress.com . "
Discussion
Nous fournissons un protocole pour isoler les testicules du mâle adulte de Drosophila melanogaster. Parce que la technique nécessite la coordination de deux de ses mains, la compétence vient seulement avec la pratique.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Vasia Vagin pour l'introduction de cette technique dans notre laboratoire.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
