Summary
Drosophila melanogaster testicoli possono essere rapidamente ed efficacemente isolato da maschi adulti con aghi dissezione. Con la pratica, si può facilmente isolare in uno o due giorni una quantità di testicoli sufficiente per l'analisi del DNA o RNA mediante sequenziamento throughput elevato o più tradizionali metodi di biologia molecolare o di proteine per i test degli anticorpi-o a base di enzimi.
Abstract
I testicoli di Drosophila melanogaster fornire un importante modello per lo studio della manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali, la meiosi, e soma-germinale interazioni. I testicoli sono tipicamente isolate da maschi adulti 0-3 giorni dopo eclosion dal caso pupa. I testicoli di wild-type mosche sono facilmente distinguibili da altri tessuti perché sono gialle, ma i testicoli del bianco mosche mutanti, un background genetico comune per esperimenti di laboratorio sono simili in forma e colore per l'intestino volare. Esecuzione di dissezione su un vetrino di vetro con uno sfondo nero rende l'identificazione dei testicoli molto più semplice. Testicoli vengono rimossi dalle mosche utilizzando aghi dissezione. Rispetto ai protocolli che utilizzano pinze per la dissezione dei testicoli, il nostro metodo è molto più veloce, che consente una ben praticata individuale di sezionare testicoli 200-300 wild-type vola per ora, cedendo 400-600 testicoli. Testicoli dalle mosche bianche o da mutanti che riducono le dimensioni dei testicoli sono più difficili da analizzare e in genere resa testicoli 200-400 all'ora.
Protocol
- Fare un vetrino da microscopio in vetro con uno sfondo nero: Tagliare carta da 20 # bianco delle stesse dimensioni del vetrino da microscopio. Colore un lato della slide-nero Taglia carta con un pennarello indelebile (ad esempio, Sharpie). Applicare la colla bianca (Elmer) per il lato nero e aderire la carta alla diapositiva. La presentazione può essere riutilizzato. Utilizzando ¾ "tape label (Fisherbrand), fissare il vetrino da microscopio, vetro laterale alto, al pad CO 2 volare a fissarlo.
- Raccogliere 0-3 vola maschio giorno.
- Preparare un secchio di ghiaccio, PBS (PBS), aghi di dissezione.
- Anestetizzare 50-100 vola utilizzando un flusso di CO 2 e trasferirli dalla bottiglia o flacone per il pad volare vicino al vetrino da microscopio.
- Pipettare ~ 50 microlitri ghiaccio PBS freddo in una goccia nel mezzo del vetrino da microscopio.
- Delicatamente prendere un moscerino maschio con la dissezione ago-dip l'ago dissezione in PBS, tocco gentile lato ventrale (cioè, in prossimità delle ali) della mosca con l'ago posto in una goccia di PBS.
- Posto un ago al centro della mosca, tra il torace e l'addome, spingendo con decisione. Posizionare l'ago altro tra il sesto (A6) e settimo (A7) segmenti addominali (le strisce secondo e il terzo dal basso); tirare l'addome di distanza dal torace.
- Stuzzicare i testicoli a parte altri organi, in particolare dell'intestino. Soprattutto in mutanti bianco, testicoli e intestino simile. Differenze principali sono che testicoli vengono sempre a coppie, ognuna testicolo è un percorso a spirale ed è più di colore bianco che nell'intestino.
- Conservare i testicoli nella gelida PBS in una provetta polipropilene.
Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Vista dorsale del sistema riproduttivo maschile, da flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase attribuzione:... "Dopo Figura 38 A a pagina 508 di Miller (1950) A. Miller, L'anatomia interna e istologia della imago di Drosophila melanogaster In M. Demerec, editore, Biologia della Drosophila, capitolo 6, pagine 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, edizione facsimile, 1994. Copyright 1994 da Cold Spring Harbor Laboratory Press. Utilizzato per gentile concessione del Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Premere. Vedere http://www.cshlpress.com ".
Discussion
Forniamo un protocollo per isolare i testicoli di adulto maschio di Drosophila melanogaster. Perché la tecnica richiede coordinamento proprio due mani, l'abilità viene solo con la pratica.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Vasia VAGIN per l'introduzione di questa tecnica nel nostro laboratorio.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
