Dissection du cœur chez les larves, le poisson zèbre juvéniles et adultes, Danio rerio</em
Summary
Une méthode claire et standardisée pour la dissection et l'isolement du cœur poisson zèbre à de multiples stades de développement sont décrits. Techniques d'annotation et de quantification sont également discutés.
Abstract
Le poisson zèbre sont devenus un organisme modèle utile et pratique pour l'étude du développement embryonnaire, le cœur (voir commentaires récents 1-6), cependant, le travail examinant post-embryonnaire par le développement cardiaques adultes a été limité 7-10. Examiner la morphologie changeante du coeur de maturation et le vieillissement sont limitées par le manque de techniques disponibles pour la stadification et isoler les cœurs juvéniles et adultes. Afin d'analyser le développement cardiaque sur la durée de vie du poisson, nous disséquons coeurs poisson zèbre à de nombreux stades et les photographier pour une analyse ultérieure 11. Les caractéristiques morphologiques du cœur peuvent être facilement quantifiés et des coeurs individuels peuvent être analysés ultérieurement par une foule de méthodes standard. Zebrafish croître à des taux variables et de la maturation meilleure corrélation avec la taille des poissons que l'âge, donc, après la fixation, la longueur du poisson, nous photographier et mesurer comme un indicateur de la maturation des poissons. Ce protocole explique deux distincts, la taille de techniques de dissection à charge pour le poisson-zèbre, allant de 3,5 mm de longueur standard des larves (SL) avec des coeurs de la longueur du ventricule 100 microns (VL), aux adultes, avec SL de 30mm et VL 1mm ou plus. Poissons larvaires et adultes ont le corps bien distincts et la morphologie d'organes. Les larves ne sont pas seulement beaucoup plus petit, ils ont moins de pigments et de chaque organe est visuellement très difficiles à identifier. Pour cette raison, nous utilisons des techniques de dissection distinctes.
Nous avons utilisé des procédures pré-dissection de fixation, comme nous avons découvert que les cœurs disséqués directement après l'euthanasie ont une morphologie plus variable, avec ballon très lâche et comme oreillettes rapport avec des coeurs enlevés après fixation. Le poisson fixés avant la dissection, de conserver la morphologie in vivo et la position de chambre (données non présentées). En outre, à des fins de démonstration, nous profitons du coeur (infarctus) spécifiques GFP transgéniques Tg (myl7: GFP) twu34 (12), ce qui nous permet de visualiser le cœur entier et est particulièrement utile aux premiers stades de développement lorsque les cardiaques morphologie est moins distinctes à partir des tissus environnants. Dissection du cœur fait une analyse plus approfondie de la biologie cellulaire et moléculaire sous-jacente de développement du cœur et de la maturation en utilisant l'hybridation in situ, immunohistochimie, l'extraction d'ARN ou d'autres méthodes analytiques plus facile en post-embryonnaire du poisson zèbre. Ce protocole fournira une technique précieuse pour l'étude de la maturation et le vieillissement de développement cardiaque.
Protocol
Discussion
Ces méthodes pour la dissection du cœur du poisson zèbre post-embryonnaire des poissons permet l'élimination complète d'un cœur en bon état. Bien que cette technique est simple et fournit des guides pour des coupes externes qui permettra d'éviter d'endommager le cœur, une main ferme est essentiel pour les petits poissons.
Une étape clé lors de la dissection est d'identifier le péricarde argentée comme le cœur est directement dans ce sac. Visualiser le péric…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez et Arelys Uribe. Ce travail a été soutenu en partie par CUNY Research Foundation et Howard Hughes Medical Institute Programme d'été de subvention pour les étudiants (Spur) et NIH RO3 41702-00-01. La recherche a été également soutenue par Queens College et quelques-unes des expériences ont été effectuées sur l'équipement de la Core Facility for Imaging, biologie cellulaire et moléculaire au Queens College.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
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