Сердце Dissection в личинок, несовершеннолетних и взрослых данио рерио, Danio rerio</em
Summary
Ясно, стандартизованный метод вскрытия и изоляции данио сердце в несколько этапов развития, описаны. Аннотация и количественного методов, также обсуждаются.
Abstract
Данио рерио стали выгодными и практическую модель организма для исследования эмбрионального развития сердца (см. недавние обзоры 1-6), однако, работа изучения постэмбрионального до взрослых сердечных развитие было ограничено 7-10. Рассматривая изменения морфологии созревания и старения сердца ограничены из-за отсутствия методик для постановки и изоляции несовершеннолетних и взрослых сердец. Для анализа развития сердца в течение жизни рыбы, мы проанализируем данио сердца на многочисленных этапах и сфотографировать их для дальнейшего анализа 11. Морфологические особенности сердца может быть легко количественно и индивидуальных сердца может быть дополнительно проанализирован целый ряд стандартных методов. Данио рерио растут при переменной ставки и созревания лучше коррелирует с рыбой размера, чем возраст, таким образом, после фиксации мы фотографией и измерить длину рыбы в качестве датчика рыбы созревания. Этот протокол объясняет две различные, зависит от размера методы вскрытия для рыбок данио, начиная от личинок 3,5 мм длина стандартного (SL), с сердцами 100 мкм длиной желудочка (ВЛ), для взрослых, с SL 30 мм и В. Л. 1мм и более. Личинки и взрослые рыбы имеют совершенно различные тела и органов морфологии. Личинки не только значительно меньше, у них меньше пигмента и каждый орган визуально очень трудно идентифицировать. По этой причине, мы используем различные методы вскрытия.
Мы использовали предварительно рассечение процедуры фиксации, как мы выяснили, что сердца расчлененный непосредственно после euthanization имеют более изменчивой морфологией, с очень рыхлой и воздушный шар, как предсердий по сравнению с сердечками удалены после записи. Рыба фиксированной до вскрытия, сохраняют в морфологии естественных и камерной позиции (данные не приведены). Кроме того, в демонстрационных целях, мы воспользуемся сердца (инфаркт) конкретных GFP трансгенные Tg (myl7: GFP) twu34 (12), что позволяет визуализировать весь сердца и особенно полезно на ранних стадиях развития, когда сердечная морфологией менее отлична от окружающих тканей. Препарирование сердце делает дальнейший анализ клеточной и молекулярной биологии основного развития сердца и созревания использования в гибридизация, иммуногистохимии, выделения РНК или других аналитических методов легче в постэмбрионального рыбок данио. Этот протокол будет предоставлять ценную технику для изучения сердечных созревания развития и старения.
Protocol
Discussion
Эти методы вскрытия данио сердце постэмбрионального рыбы позволяет полное удаление неповрежденной сердце. Хотя этот метод прост и дает направляющие для внешних разрезов, что позволит предотвратить повреждение сердца, твердая рука, имеет важное значение для более мелких рыб.
<p class="jo…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодаря Марии Birne, Areti Tsiola, Джейми Эстевез и Arelys Урибе. Эта работа была частично поддержана CUNY Фонд исследований и Медицинского института Говарда Хьюза Грант летняя программа для студентов (шпора) и NIH RO3 41702-00-01. Исследование было поддержано Queens College и некоторые эксперименты были выполнены на оборудовании от основной фонд для работы с изображениями, клеточной и молекулярной биологии в Квинс Колледж.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (1995).
