Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio</em
Summary
Un chiaro, metodo standardizzato per la dissezione e l'isolamento del cuore zebrafish a più stadi di sviluppo sono descritti. Tecniche di annotazione e la quantificazione vengono anche discussi.
Abstract
Zebrafish sono diventati un organismo modello utile e pratico per lo studio dello sviluppo embrionale cuore (vedi recensioni più recenti 1-6), tuttavia, il lavoro esaminando post-embrionale attraverso lo sviluppo cardiaco adulto è stato limitato 7-10. Esaminando la morfologia cambia del cuore maturazione e l'invecchiamento sono limitate dalla mancanza di tecniche disponibili per la stadiazione e isolare i cuori giovani che adulti. Al fine di analizzare lo sviluppo cuore oltre la durata della vita del pesce, si sezionano i cuori pesce zebra in numerose fasi e fotografarli per ulteriori analisi 11. Le caratteristiche morfologiche del cuore può essere facilmente quantificata e cuori individuali possono essere ulteriormente analizzati da una serie di metodi standard. Zebrafish crescere a tassi variabili e la maturazione si correla meglio con dimensione dei pesci di età, quindi, post-fissazione, abbiamo lunghezza pesce fotografare e misurare come un indicatore di maturazione di pesce. Questo protocollo spiega due distinte tecniche di dissezione dimensioni dipendenti per zebrafish, che vanno dalla lunghezza standard di larve da 3,5 mm (SL) con i cuori di lunghezza ventricolo 100μm (VL), agli adulti, con SL di 30mm e VL 1mm o più grandi. Larve e adulti hanno il corpo ben distinte e la morfologia degli organi. Le larve non sono solo molto più piccoli, hanno meno pigmento e ogni organo è visivamente molto difficile da identificare. Per questa ragione, usiamo tecniche di dissezione distinte.
Abbiamo usato pre-dissezione procedure di fissaggio, come abbiamo scoperto che il cuore sezionato direttamente dopo euthanization hanno una morfologia più variabile, con palloncino molto sciolto e, come atri rispetto al cuore rimosso fissazione seguente. Il pesce fisso prima di dissezione, trattenere in vivo la morfologia e la posizione della camera (dati non riportati). In aggiunta, a scopo dimostrativo, approfittiamo del cuore (infarto) specifiche GFP transgenici Tg (myl7: GFP) twu34 (12), che ci permette di visualizzare il cuore e il servizio è particolarmente utile nelle fasi iniziali di sviluppo quando la cardiaco morfologia è meno distinto dai tessuti circostanti. Dissezione del cuore fa un'ulteriore analisi della biologia cellulare e molecolare alla base dello sviluppo del cuore e con la maturazione di ibridazione in situ, immunoistochimica, estrazione di RNA o altri metodi analitici più facile in post-embrionale di zebrafish. Questo protocollo fornisce una valida tecnica per lo studio della maturazione dello sviluppo cardiaco e l'invecchiamento.
Protocol
Discussion
Questi metodi per la dissezione del cuore zebrafish di post-embrionale di pesce permette la rimozione completa di un cuore integro. Mentre questa tecnica è semplice e fornisce guide per tagli esterni che evitare di danneggiare il cuore, una mano ferma è essenziale per i più piccoli pesci.
Un passo fondamentale durante la dissezione è quello di identificare il pericardio argenteo come il cuore è direttamente all'interno di questa uscita. Visualizzando il pericardio fornisce un indica…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie a Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez e Arelys Uribe. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da CUNY Research Foundation e Howard Hughes Medical Institute programma estivo di sovvenzione per gli studenti universitari (SPUR) e NIH RO3 41702-00-01. La ricerca è stata sostenuta anche dal Queens College e alcuni degli esperimenti sono stati fatti su apparecchi dal Fondo Core for Imaging, Biologia Cellulare e Molecolare al Queens College.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
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