Hart Dissection in larvale, jeugdige en volwassen zebravis, Danio rerio</em
Summary
Een duidelijke, gestandaardiseerde methode voor dissectie en isolatie van de zebravis hart op meerdere ontwikkelingsstadia worden beschreven. Annotatie en kwantificatie technieken worden ook besproken.
Abstract
Zebravis zijn uitgegroeid tot een nuttig en praktisch modelorganisme voor de studie van de embryonale ontwikkeling van het hart (zie recente recensies 1-6), werken echter te onderzoeken post-embryonale via volwassenenonderwijs ontwikkeling van het hart is beperkt 7-10. Onderzoeken van de veranderende morfologie van de rijping en veroudering hart zijn beperkt door het gebrek aan technieken beschikbaar voor het organiseren en het isoleren van jeugdige en volwassen harten. Om de ontwikkeling van het hart te analyseren gedurende de levensduur van de vis, ontleden we zebravis harten op tal van podia en fotograferen ze voor verdere analyse 11. De morfologische kenmerken van het hart kan gemakkelijk worden gekwantificeerd en de individuele harten kan verder worden geanalyseerd door een groot aantal standaard methoden. Zebravis groeien variabele rente en de rijping correleert beter met grootte van de vis dan leeftijd, dus post-fixatie, we fotograferen en meten vis lengte als een graadmeter van vis rijping. Dit protocol legt uit twee verschillende, grootteafhankelijke dissectie technieken voor zebravis, variërend van larven 3.5mm standaard lengte (SL) met een hart van 100 urn ventrikel lengte (VL), voor volwassenen, met SL van 30mm en VL 1 mm of groter. Larvale en volwassen vissen hebben zeer verschillend lichaam en orgel morfologie. Larven zijn niet alleen aanzienlijk kleiner, ze hebben minder pigment en elk orgaan is visueel erg moeilijk te identificeren. Om deze reden maken we gebruik van verschillende dissectie technieken.
We gebruikten pre-dissectie fixatie, zoals wij ontdekten dat de harten direct ontleed na euthanization een meer variabele morfologie hebben, met zeer losse en ballon, zoals atria in vergelijking met hartjes verwijderd na fixatie. De vis vast voorafgaand aan de dissectie, te behouden in vivo morfologie en kamer positie (gegevens niet getoond). Bovendien, voor demonstratiedoeleinden, we profiteren van het hart (myocard) specifieke GFP transgene Tg (myl7: GFP) twu34 (12), die ons in staat stelt te visualiseren het hele hart en is met name nuttig in een vroeg stadium in de ontwikkeling als de cardiale morfologie is minder onderscheiden van omliggende weefsels. Dissectie van het hart maakt verdere analyse van de cel-en moleculaire biologie onderliggende ontwikkeling van het hart en rijping behulp van in situ hybridisatie, immunohistochemie, RNA-extractie of andere analytische methoden gemakkelijker in post-embryonale zebravis. Dit protocol zal een waardevolle techniek voor de studie van ontwikkeling van het hart rijping en veroudering.
Protocol
Discussion
Deze methoden voor dissectie van de zebravis hart van de post-embryonale vis maakt het mogelijk om volledige verwijdering van een onbeschadigd hart. Hoewel deze techniek is eenvoudig en geeft gidsen voor externe bezuinigingen die voorkomt dat schade aan het hart, een vaste hand is essentieel voor kleinere vissen.
Een belangrijke stap tijdens de dissectie is om de zilverachtige hartzakje identificeren als het hart is direct in deze weg. Het visualiseren van de pericard vormt een belangrijke m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Met dank aan Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez en Arelys Uribe. Dit werk werd mede ondersteund door CUNY Research Foundation en Howard Hughes Medical Institute Grant zomerprogramma voor studenten (SPUR) en NIH RO3 41702-00-01. Onderzoek werd ook gesteund door Queens College en sommige van de experimenten werden uitgevoerd op apparatuur van de Core Facility for Imaging, Cellulaire en Moleculaire Biologie aan Queens College.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (1995).
