En funktionell helblodsanalys att mäta livskraft mykobakterier, med hjälp av Reporter-Gene taggade BCG eller M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Summary

Vi beskriver en alternativ metod till i uppräkningen av mykobakterier<em> In vitro</em>, Som använder reporter-genen taggade mykobakterier istället för kolonibildande enheter (CFU). "Survival" av organismer samt immunförsvar-markörer mäts samtidigt, vilket ger en låg kostnad, mångsidig och fungerande system för studier av värd / patogen interaktioner i samband med tuberkulos.

Abstract

Funktionella analyser har länge spelat en nyckelroll i att mäta immunogenicitet av en viss vaccin. Detta är konventionellt uttryckt som serum bakteriedödande titrar. Studier av serum bakteriedödande titrar som svar på barnvacciner har gjort det möjligt för oss att utveckla och validera cut-off nivåer för skyddande immunsvar och sådant cut-off är i rutinmässig användning. Inga sådana analyser har tagits fram i rutinen bedömning av vacciner som inducerar främst cell-medierad immunitet i form av effektor T cells svar, såsom tuberkulos vacciner. I djurmodell, är resultatet av ett visst vaccin kandidat rutinmässigt utvärderas i standardiserade bakteriedödande analyser, och alla nuvarande nya tbc-vaccinkandidater har utsatts för detta steg i sin utvärdering före fas 1 försök på människa. Bedömningen av immunogenicitet och därmed sannolikheten för skyddande effekten av nya anti-tbc vaccin bör helst genomgå en liknande stegvis utvärdering i den mänskliga modeller nu, även mätningar i bakteriedödande analyser.

Bakteriedödande analyser i samband med tuberkulos vaccin forskningen redan är väl etablerade i djurmodeller, där de tillämpas på skärmen potentiellt lovande vaccinkandidater. Minskning av bakteriehalten i olika organ fungerar som de viktigaste avläsning av immunogenicitet. Dock har inga sådana analyser införlivats i kliniska prövningar för nya anti-tbc vaccin hittills.

Även om det fortfarande osäkerhet om de exakta mekanismer som leder till dödandet av mykobakterier inne mänskliga makrofager, är interaktionen mellan makrofager och T-celler med mykobakterier klart krävs. Analysen som beskrivs i detta dokument representerar en ny generation av bakteriedödande analyser som möjliggör studier av sådana viktiga cellulära komponenter med alla andra cellulära och humorala faktorer i helblod utan att göra antaganden om deras relativa individuella bidrag. Analysen beskrivs av vår grupp använder små mängder av blod och har redan använts i studier av vuxna och barn i TB-endemiska inställningar. Vi har visat immunogenicitet av BCG-vaccinet, ökad tillväxt av svamp inom HIV-positiva patienter, samt effekten av antiretroviral behandling och vitamin D på mykobakteriella överlevnad in vitro. Här kan vi sammanfatta metoden och presentera våra reproducerbarhet data med hjälp av denna relativt enkla, billiga och fält-vänlig modell.

OBS: Definitioner / Förkortningar

BCG-lux = M. bovis BCG, Montreal stam, förvandlas med skyttel plasmid pSMT1 bär luxAB gener från Vibrio harveyi, under kontroll av mykobakteriell GroEL (hsp60) promotor.
CFU = Colony Forming enhet (ett mått på mykobakteriella bärkraft).

Protocol

1. Beredning av BCG-lux reporter mykobakterier lager Grow BCG lux (M. bovis BCG Montreal stam förvandlas med rymdfärjan plasmiden pSMT1) med skakning på 200rpm till mitten av logaritmiska fas i Middlebrook 7H9 buljong innehåller 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 och 10% ADC anrikning. Förbered 1 ml av en 1:10 spädning av BCG-lux kultur i sterila PBS i en luminometer rör (900μl PBS + 100μl BCG lux kultur) i två exemplar. Ladda röret med N-decyl ald…

Discussion

Bakteriedödande analyser i samband med tuberkulos vaccin forskningen är väl etablerat i djurmodeller, där de tillämpas på skärmen potentiellt lovande vaccinkandidater. Minskning av bakteriehalten i olika organ fungerar som de viktigaste avläsning av immunogenicitet.

Den första generationen av mänskliga bakteriedödande analyser har utformats med hjälp av makrofager ensam, infekterade med M. tuberkulos. CFU var den viktigaste avläsning av mykobakteriell överlevnad efter …

Materials

Reagent	Company	Cat No
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Equipment
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning from VWR	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	any
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	any
General laboratory equipment:
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures