Mikobakteriler canlılık Tedbir Fonksiyonel Tam Kan Testi, Reporter Gen BCG veya M. Tb (BCG Takip edilen konu kullanarak Lüks / M. Tb Lüks)
Summary
Mikobakterilerin numaralandırma için alternatif bir yaklaşım tarif<em> In vitro</em, Muhabir-gen kullanan> yerine koloni oluşturan birim (CFU) mikobakteriler etiketli. Organizmalar "Survival" gibi bir konak cevabı belirteçler tüberküloz bağlamda ev sahibi / patojen etkileşimleri çalışmaları için düşük maliyetli, çok yönlü ve fonksiyonel bir sistem, aynı anda ölçülür.
Abstract
Fonksiyonel testlerin uzun süre belirli bir aşı immünojenite ölçme önemli bir rol oynamıştır. Bu, geleneksel serum bakterisidal titreleri olarak ifade edilir. Çocukluk aşıları yanıt serum bakterisidal titreleri çalışmaları rutin olarak kullanılması, koruyucu bağışıklık yanıtlarını ve bu cut-off için seviyelerini geliştirmek ve cut-off doğrulamak sağlamıştır. Testler TB aşıları gibi efektör T hücre yanıtları şeklinde öncelikle hücre-aracılı bağışıklık neden olan aşıların rutin değerlendirme içine ileri atılmıştır. Hayvan modeli, belirli bir aşı adayı performans rutin standart bakterisidal tayinlerde değerlendirilir ve mevcut tüm roman TB aşı adayı 1 insan çalışmalarda faz önce bu adımı değerlendirilmesi maruz kalmış. Immünojenite ve bu nedenle yeni anti-TB aşıların koruyucu etkinlik olasılığını değerlendirme ideal bakterisidal testleri ölçümleri de dahil olmak üzere, insan modelleri benzer bir adım akıllıca değerlendirme geçmelidir.
Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri zaten iyi, hayvan modellerinde yılında kurulmuş olan. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması. Ancak, bugüne kadar yeni anti-TB aşıları için böyle testleri klinik çalışmalarda içine dahil edilmiştir.
Mikobakterilerin insan makrofaj içinde öldürülmesi neden tam mekanizmaları hakkında belirsizlik hala var olmasına rağmen, mikobakteriler ile makrofaj ve T hücrelerinin etkileşimi açıkça gereklidir. Bu yazıda anlatılan testi onların göreceli bireysel katkı hakkında varsayımlar yapmadan tam kan mevcut diğer tüm hücresel ve humoral faktörler gibi temel hücresel bileşenleri çalışmaları sağlar bakterisidal testlerinin bir roman neslini temsil ediyor. Grubumuz tarafından açıklanan tam kan tahlil küçük hacimlerde kullanır ve zaten TB-endemik ayarları yetişkinler ve çocuklar çalışmalarda istihdam edilmiştir. Biz, BCG aşısı immünojenite gösterilen mikobakterilerin büyüme, HIV-pozitif hastalarda mikobakteriyel sağkalım üzerine in vitro anti-retroviral tedavi ve D vitamini etkisinin yanı sıra artmıştır. Burada metodoloji özetlemekte ve bu nispeten basit, düşük maliyetli ve sahada dostu bir model kullanarak tekrarlanabilirlik veri mevcut.
Not: Tanımlar / Kısaltmalar
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal gerilme, mikobakteriyel GroEL (hsp60) promotör kontrolü altında, Vibrio harveyi luxAB genleri taşıyan servis plazmid pSMT1 dönüştürdü.
CFU = Koloni Oluşturan Birim (mikobakteriyel canlılığının bir önlem).
Protocol
Discussion
Potansiyel olarak gelecek vaat eden aşı adayı ekrana uygulanır, tüberküloz aşısı araştırmaları bağlamında Bakterisit deneyleri, hayvan modellerinde de kurulmuştur. Ana immünojenite, okuma gibi çeşitli organların fonksiyonları bakteri yükünün azaltılması.
M. enfekte insan bakterisidal testlerinin ilk nesil, tek başına makrofajlar kullanılarak dizayn edilmiştir tüberküloz. CFU, en az 3 haftalık bir süre sonra ana mikobakteriyel hayatta kalma o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Wellcome Trust Beate Kampmann (056.608, GRO77273) için kişisel burslar tarafından finanse edildi.
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 .
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
