一个功能全血含量测量分枝杆菌的生存能力，记者基因标记卡介苗或M. TB（卡介苗勒克斯 / M. TB勒克斯）
Summary
我们描述了一个替代的方法来列举分枝杆菌<em>在体外</em>，它使用的记者基因标记，而不是细胞集落形成单位（CFU）的分枝杆菌。 “生存”的生物体，以及宿主反应的标记，同时测量，提供一个低成本，灵活和功能系统在结核病中的主机/病原体相互作用的研究。
Abstract
功能测定早已起到了关键作用的一个给定的疫苗的免疫原性的测量。这是常规表现为血清杀菌滴度。儿童疫苗的血清杀菌滴度的研究使我们能够开发和验证切断保护性免疫反应的水平和削减权衡，在日常使用。没有这样的检测已采取迈进的诱导主要是细胞免疫效应T细胞反应的形式，如结核病疫苗，疫苗的例行评估。表现一个给定的候选疫苗在动物模型，定期评估标准化杀菌检测，目前所有的新型结核病疫苗候选人受到这一步在他们的评价，第1阶段的人体试验之前。理想的免疫原性，因此，新型抗结核病疫苗的保护效力的可能性的评估应在人体模型进行类似的分步进行的评价，现在，包括杀菌实验的测量。
杀菌检测在结核病疫苗研究方面已经建立的动物模型，它们应用到屏幕上可能有前途的候选疫苗。作为主要的免疫原性读出各个器官功能的细菌负荷减少。然而，没有这样的检测已被纳入临床试验新型抗结核病疫苗的最新。
虽然仍存在不确定性的确切机制，导致人类巨噬细胞内结核分枝杆菌杀，分枝杆菌与巨噬细胞和T细胞的相互作用是明确要求。本文中所描述的实验代表的新型杀菌检测等关键的细胞成分的研究，使全血中目前没有作出有关其相对独立的贡献的假设与所有其他细胞和体液因素。本集团所描述的检测使用全血的小卷，并已受聘在成人和儿童的研究结核病流行的设置。我们已经表明BCG疫苗的免疫原性，增加分枝杆菌的增长，在HIV阳性患者，以及抗逆转录病毒疗法和维生素 D分枝杆菌在体外生存的影响。在这里，我们总结的方法，目前我们的重复性数据，使用这个相对简单，低成本和友好的领域模型。
注：定义/缩写
卡介苗勒克斯= M 牛卡介苗，蒙特利尔应变，转化与穿梭质粒进行哈维氏弧菌的luxAB基因pSMT1，分枝杆菌GroEL的（HSP60）启动子的控制下。
CFU =集落形成单位（结核分枝杆菌的可行性措施）。
Protocol
1。卡介苗勒克斯记者分枝杆菌股票的制备成长卡介苗LUX（牛分枝杆菌卡介苗蒙特利尔应变穿梭质粒pSMT1的转化）用颤 抖的Middlebrook 7H9肉汤含0.2％甘油，0.05％Tween 80和10％的ADC浓缩在200rpm中旬对数生长期。 在光度计试管一式两份（900μlPBS +100μL卡介苗勒克斯文化），准备在无菌PBS 1:10稀释的卡介苗勒克斯文化1毫升。 装入管中的N -癸醛（荧光素酶?…
Discussion
在结核病疫苗研究中的杀菌检测以及建立动物模型，它们应用到屏幕上可能有前途的候选疫苗。作为主要的免疫原性读出各个器官功能的细菌负荷减少。
人类杀菌实验的第一代设计单独使用巨噬细胞，感染与 M. 结核病 。 CFU担任分枝杆菌生存的主要读出后最短的时间为3周。依靠这些检测外周血单个核细胞，贴壁的单核细胞/巨噬细胞和裂解准备在特定时间点<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由个人从威康信托Beate Kampmann（056608，GRO77273）的奖学金。
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
References
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Tags
Whole Blood AssayViability MeasurementMycobacteriaReporter-gene Tagged BCGReporter-gene Tagged M.TbFunctional AssaysImmunogenicity MeasurementSerum Bactericidal TitersChildhood VaccinesCut-off LevelsProtective Immune ResponsesCell-mediated ImmunityEffector T Cell ResponsesTB VaccinesAnimal Model EvaluationNovel TB-vaccine CandidatesPhase 1 Human TrialsAssessment Of ImmunogenicityProtective EfficacyAnti-TB VaccinesBactericidal AssaysTuberculosis Vaccine Research
Cite This Article
Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). J. Vis. Exp. (55), e3332, doi:10.3791/3332 (2011).