وظيفية فحص الدم لقياس الجامعة صلاحية مايكوباكتيريا ، وذلك باستخدام الجينات المرتبطة دلاليا مراسل بي سي جي إم أو السل (BCG لوكس / M. التربيوم لوكس)
Summary
نحن تصف نهجا بديلا للتعداد متفطرات<em> في المختبر</em> ، والذي يستخدم مراسل الجينات الموسومة متفطرات بدلا من الوحدات المكونة للمستعمرة (كفو). "البقاء" من الكائنات الحية ، فضلا عن استضافة الاستجابة علامات. تقاس في وقت واحد ، وتوفير منخفضة التكلفة ، ونظام متعدد الاستعمالات والوظيفية للدراسات المضيف / الممرض التفاعلات في سياق السل
Abstract
لقد لعبت المقايسات الفنية لفترة طويلة دورا رئيسيا في قياس استمناع لقاح معين. وأعرب عن تقليدية هذا النحو التتر جراثيم المصل. وقد مكنت الدراسات من التتر جراثيم المصل في الاستجابة لقاحات الطفولة لنا لتطوير والتحقق من وقف انتاج المواد الانشطارية لمستويات الحماية والاستجابات المناعية مثل خفض العرضية في الاستخدام الروتيني. وقد اتخذت هذه المقايسات إلى الأمام لا إلى تقييم لقاحات الروتينية التي تحفز الخلايا في المقام الأول بوساطة الحصانة في شكل المستجيب استجابات الخلايا التائية ، مثل لقاحات السل. في نموذج حيواني ، يتم تقييم أداء روتيني لمرشح معين في لقاح للجراثيم المقايسات الموحدة ، وتعرضوا جميعا الحالي رواية لقاح السل المرشحين لهذه الخطوة في تقييمها قبل مرحلة التجارب على الانسان 1. وينبغي تقييم استمناع وبالتالي احتمال فعالية اللقاحات الواقية المضادة للسل رواية الخضوع مثالي مماثل خطوة حكيمة التقييم في النماذج البشرية الآن ، بما في ذلك القياسات في المقايسات للجراثيم.
هي راسخة المقايسات للجراثيم في سياق البحوث قاح السل في النماذج الحيوانية ، حيث يتم تطبيقها على الشاشة اللقاحات المرشحة اعدة. تخفيض الحمولة الجرثومية في وظائف الأجهزة المختلفة كما الرئيسي للقراءة من استمناع. ومع ذلك ، فقد أدرجت هذه المقايسات في أي التجارب السريرية للقاحات المضادة للسل الرواية حتى الآن.
على الرغم من أنه لا يزال الغموض حول الآليات الدقيقة التي تؤدي إلى قتل متفطرات الضامة داخل الإنسان ، فهناك حاجة واضحة للتفاعل الضامة ، والخلايا التائية مع متفطرات. في مقايسة وصفها في هذه الورقة تمثل جيلا جديدا من المقايسات للجراثيم التي تمكن من الدراسات لهذه المكونات الخلوية الرئيسية مع جميع العوامل الأخرى الخلوية والخلطية موجودة في الدم كله ، من دون الادلاء افتراضات حول مساهمتهم الفردية النسبي. المقايسة التي وصفها مجموعتنا يستخدم كميات صغيرة من الدم الكامل وبالفعل استخدمت في دراسات من البالغين والأطفال في السل المتوطن الإعدادات. لقد أظهرنا استمناع من لقاح بي سي جي ، وزيادة نمو المتفطرات في المرضى المصابين بالفيروس ، فضلا عن تأثير العلاج المضاد للفيروس وفيتامين (د) على البقاء على قيد الحياة الفطرية في المختبر. نحن هنا تلخيص هذه المنهجية ، وتقديم بيانات استنساخ لنا باستخدام هذا النموذج البسيط نسبيا ، وانخفاض التكلفة ومجال الاستخدام.
ملاحظة : التعاريف / المختصرات
BCG = م لوكس BCG البقرية ، مونتريال السلالة ، حولت المكوك مع pSMT1 بلازميد يحمل جينات من luxAB harveyi الضمة ، تحت سيطرة GroEL بالمتفطرات (hsp60) المروج.
كفو وحدة مستعمرة = التشكيل (وهو مقياس لقابلية الفطرية).
Protocol
Discussion
هي راسخة المقايسات للجراثيم في سياق البحوث قاح السل في النماذج الحيوانية ، حيث يتم تطبيقها على الشاشة اللقاحات المرشحة اعدة. تخفيض الحمولة الجرثومية في وظائف الأجهزة المختلفة كما الرئيسي للقراءة من استمناع.
تم تصميم الجيل الأول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شخصية من الزمالات ويلكوم ترست لKampmann بياتي (056608 ، GRO77273).
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 .
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
