Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)
Summary
אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של mycobacteria<em> במבחנה</em>, אשר משתמשת הכתב, גן מתויג mycobacteria במקום להרכיב המושבה יחידות (CFU). "הישרדות" של אורגניזמים כמו גם לארח בתגובה-סמנים נמדדים בעת ובעונה אחת, מתן בעלות נמוכה, מערכת תכליתי ופונקציונלי ללימודים של המארח / הפתוגן אינטראקציות בהקשר של שחפת.
Abstract
מבחני פונקציונלית שיחקו זמן רב תפקיד מרכזי מדידה של immunogenicity של החיסון נתון. זה בא לידי ביטוי קונבנציונלית כמו titers bactericidal בסרום. מחקרים titers bactericidal בסרום בתגובה חיסונים בילדות אפשרו לנו לפתח לאמת חתוכים רמות המערכת החיסונית מגן כגון לחתוך-offs נמצאים בשימוש שגרתי. מבחני אין כאלה ננקטו קדימה לתוך הערכה שגרת חיסונים לגרום בעיקר התא בתיווך חסינות בדמות מפעיל התגובות תא T, כגון שחפת חיסונים. במודל חיה, הביצועים של מועמד חיסון נתון מוערך באופן שגרתי מבחני bactericidal סטנדרטית, וכל הנוכחית TB-חיסון מועמדים הרומן היה נתון בשלב זה להערכה שלהם לפני שלב 1 בניסויים בבני אדם. הערכת immunogenicity ולכן הסבירות של יעילות ההגנה של החיסון נגד שחפת רומן רצוי לעבור הערכה דומה צעד חכם של מודלים אנושיים עכשיו, כולל מדידות מבחני bactericidal.
מבחני bactericidal בהקשר של מחקר חיסון שחפת כבר מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. עם זאת, אין מבחני כאלה שולבו ניסויים קליניים עבור חיסון נגד שחפת הרומן עד כה.
אמנם יש עדיין אי ודאות לגבי המנגנונים המדויקים שהובילו להרג של mycobacteria בתוך מקרופאגים אדם, האינטראקציה של מקרופאגים ותאי T עם mycobacteria נדרש בבירור. Assay המתואר במאמר זה מייצג דור חדש של מבחני bactericidal המאפשר מחקרים כאלה רכיבים סלולריים מפתח עם כל הגורמים הסלולר הלחות אחרים הנמצאים בדם שלם מבלי לעשות הנחות על התרומה היחסית הפרט שלהם. Assay שתואר על ידי הקבוצה שלנו משתמשת בנפחים קטנים של דם שלם כבר המועסקים מחקרים על מבוגרים וילדים TB-אנדמיים הגדרות. הראינו immunogenicity של חיסון BCG, גדל צמיחה של mycobacteria ב חולי איידס, כמו גם את ההשפעה של טיפול אנטי retroviral וויטמין D על הישרדות mycobacterial במבחנה. כאן אנחנו מסכמים את המתודולוגיה, ולהציג נתונים reproducibility שלנו באמצעות מודל פשוט יחסית, בעלות נמוכה ושדה ידידותי.
הערה: הגדרות / קיצורים
BCG לוקס = M. בוביס BCG, זן במונטריאול, הפך עם pSMT1 מעבורת הפלסמיד נושא את הגנים luxAB מ Vibrio harveyi, תחת שליטה של GroEL mycobacterial (hsp60) מקדם.
CFU = יחידת יצירת המושבה (מדד הכדאיות mycobacterial).
Protocol
Discussion
מבחני bactericidal בהקשר של מחקר החיסון לשחפת מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity.
הדור הראשון של מבחני bactericidal א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר אישיים של קרן Wellcome כדי ביאטה Kampmann (056,608, GRO77273).
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
References
- Cheng, S. H., Walker, L. Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children. Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).
- Cheng, S. H., Walker, K. B. Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom. Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).
- Silver, R. F., Li, Q. Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions. Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).
- Hoft, D. F., Worku, S. Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity. J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).
- Worku, S., Hoft, D. F. Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).
- Kampmann, B., Gaora, P. O. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria. J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).
- Cheon, S. H., Kampmann, B. Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).
- Janulionis, E., Sofer, C. Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture. Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).
- Kampmann, B., Tena, G. N. Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines. Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).
- Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART. Aids. 20, 1011-1018 .
- Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).
