Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer
Summary
Vi har optimerat ett mikroinkapslingsteknik som ett effektivt 3D plattform för förökning och differentiering av embryonala stamceller att endoderm och dopaminerga (DA) nervceller. Det ger också en möjlighet för immun-isolering av celler från värden under transplantationen. Denna plattform kan vara anpassade för andra celltyper.
Abstract
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) växer fram som ett attraktivt alternativ källa för cell replacement therapy eftersom de kan byggas ut i kultur på obestämd tid och differentierade till alla celltyper i kroppen. Olika typer av biomaterial har också använts i stamcellskulturer att tillhandahålla en mikromiljö som imiterar den stamcell nisch 1-3. Det senare är viktigt för att främja cell-till-cell-interaktion, cellproliferation och differentiering till specifika celltyper samt vävnad, genom att presentera en tredimensionell (3D) miljö 4 såsom inkapsling. Principen för cell inkapsling omfattar instängning av levande celler inom ramarna för semi-permeabla membran i 3D kulturer 2. Dessa membran möjliggöra utbyte av näringsämnen, syre och stimuli över membranen, medan antikroppar och immunceller från värden som är större än kapseln porstorleken är undantagna 5. Här pre viskickade ett förhållningssätt till kultur och differentiera hESC DA neuron i ett 3D-mikromiljö med alginat mikrokapslar. Vi har ändrat odlingsbetingelserna 2 för att förbättra lönsamheten av inkapslat hESC. Vi har tidigare visat att tillsats av sid.160-Rho-associerad coiled-coil-kinas (ROCK)-inhibitor, Y-27.632 och humant fetalt fibroblast-konditionerat serumersättning medium (HFF-CM) till 3D plattformen förbättras avsevärt livsduglighet inkapslade hESC i vilket cellerna uttryckte slutgiltiga endoderm markörgener 1. Vi har nu använt denna 3D-plattform för spridning av hESC och effektiv differentiering till DA neuron. Protein och genuttryck analyser efter det slutliga steget av DA neuronal differentiering visade ett ökat uttryck av tyrosinhydroxylas (TH), en markör för DA-neuroner,> 100 veck efter 2 veckor. Vi antar att vår 3D-plattform med hjälp av alginat mikrokapslar kan vara användbara för att studera spridning och riktade differentieringav hESC till olika linjerna. Denna 3D Systemet möjliggör för separation av matarceller från hESC under processen för differentiering och har även potential för immun-isolering under transplantation i framtiden.
Protocol
Discussion
Flera studier med mus embryonala stamceller och hESC har visat fördelarna med 3D kultur systemet i biomaterial och vävnadsteknik 2,3. Vi använde mikrokapslar kalciumalginat som en lämplig 3D plattform för att studera hESC utbredning och differentiering i jämförelse med barium alginat då hESC visade signifikant högre överlevnad då inkapslade i kalciumalginat än barium alginat. Detta odlingssystem möjliggör också en hög densitet cellkultur och utbyte av näringsämnen och syre tvärs över membr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NHMRC Program Grant # 568.969 (PSS) och Medicinska fakulteten, University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Notes |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter healthcare | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era Pump Systems Inc | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Orive, G. Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
