Farklı soy İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) Yayılması ve Farklılaşma için 3D Platformu olarak aljinat Mikrokapsül
Summary
Biz endoderm ve dopaminerjik (DA) nöronlara yayılması ve embriyonik kök hücrelerin farklılaşması için etkili bir 3D platform olarak bir mikroenkapsülasyon tekniği optimize etmiş. Ayrıca nakli sırasında ana hücreleri bağışıklık izolasyonu için bir fırsat sağlar. Bu platform, diğer hücre türleri için adapte edilebilir.
Abstract
Süresiz kültüründe genişletilmiş ve vücutta herhangi bir hücre tiplerinin ayırt edilebilir beri İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) hücre replasman tedavisi için cazip bir alternatif kaynak olarak ortaya çıkmaktadır. Biyomateryallerin Çeşitli türleri de kök hücre niş 1-3 taklit eden bir mikro-çevre sağlamak için kök hücre kültürleri kullanılmıştır. İkinci tür kapsülleme gibi bir üç boyutlu (3B) ortamı 4 sağlayarak spesifik soyları gibi doku kuruluş içinde hücre-hücre etkileşim için-, hücre çoğalması, ve farklılaşmasını teşvik edilmesi için önemlidir. Hücre encapsulation prensibi 3D kültürleri 2 yarı geçirgen membranların sınırları içinde yaşayan hücrelerin tuzak içerir. Antikorlar ve kapsül gözenek boyutu daha büyük olan ana bilgisayardan bağışıklık hücreleri 5 dışlanır ise bu membranlar, besin, oksijen ve membranlar boyunca uyaranların değişimini sağlayacak. Burada, öncedenkültürüne bir yaklaşım gönderilen ve aljinat mikrokapsüller kullanarak 3D mikroçevresindeki hESC DA nöronları ayırt. Biz kapsüllü hESC canlılığı geliştirmek için kültür koşullarında 2 değiştirdiniz. Daha önce de göstermiştir ki, önemli ölçüde geliştirilmiş 3D platforma P160-Rho-bağlantılı sarmal-bobin kinaz (ROCK) inhibitörü, Y-27632 ve insan fetal fibroblast-şartlandırılmış serum değiştirilmesi vasatı (HFF-CM) ilavesiyle kapsüllenmiş hESC canlılığı aldığı hücreler, kesin endoderm işaretleyici gen 1 ifade etti. Şimdi DA nöronlara hESC ve verimli farklılaşma yayılması için bu 3D platformu kullandık. Protein ve gen ekspresyon analizleri DA nöronal farklılaşma son aşamasından sonra tirozin hidroksilaz artan bir ifade (TH), DA nöronlar için bir belirteç, 2 hafta sonra> 100 kıvrımlar gösterdi. Biz aljinat mikrokapsüller kullanarak bizim 3D platformu çoğalması incelemek için yararlı olabilir varsaydık ve farklılaşma yönettiÇeşitli soy için hESC arasında. Bu 3D sistemi ayrıca farklılaşma işlemi sırasında hESC gelen besleme hücrelerinin ayrılması sağlar ve aynı zamanda gelecekte transplantasyon esnasında bağışıklık-izolasyon için potansiyeli vardır.
Protocol
Discussion
Fare embriyonik kök hücreleri ve hESC kullanıldığı çeşitli çalışmalar biyomalzeme ve doku mühendisliği 2,3 3D kültür sisteminin faydalarını göstermiştir. Biz baryum aljinat fazla kalsiyum aljinat kapsüllenmiş zaman hESC anlamlı düzeyde daha canlılık gösterdi beri baryum aljinat göre hESC yayılması ve farklılaşmayı çalışmak için uygun bir 3D platform olarak kalsiyum aljinat mikrokapsüller kullanılır. Bu kültür sistemi, aynı zamanda yüksek yoğunluklu bir hücre kült?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Tıp NHMRC Programı Hibe # 568969 (PSS) ve Fakülte, New South Wales Üniversitesi, Kök Hücre Girişimi (KSS) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Notes |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter healthcare | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era Pump Systems Inc | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Orive, G. Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
