Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens
Summary
Nós otimizamos uma técnica de microencapsulação como uma plataforma eficaz para a propagação 3D e diferenciação de células-tronco embrionárias a endoderme e (DA) dopaminérgicos neurônios. Ele também fornece uma oportunidade para imuno-isolamento de células do hospedeiro durante o transplante. Esta plataforma pode ser adaptado para outros tipos de células.
Abstract
Células estaminais embrionárias (hESC) estão a emergir como uma fonte alternativa atraente para a terapia de substituição de células, uma vez que podem ser expandidas em cultura indefinidamente e diferenciados a quaisquer tipos de células no corpo. Vários tipos de biomateriais também têm sido utilizados em culturas de células estaminais para fornecer um microambiente imitando o nicho de células-tronco 1-3. O último é importante para a promoção da célula-célula interacção, a proliferação celular e diferenciação em linhagens específicas, bem como organização do tecido, proporcionando uma imagem tridimensional ambiente (3D) 4, tais como encapsulação. O princípio de encapsulamento de células envolve o aprisionamento de células vivas dentro dos limites de membranas semi-permeáveis em culturas 3D 2. Estas membranas permitir a troca de nutrientes de oxigénio, e os estímulos através das membranas, enquanto que os anticorpos e células do sistema imunológico do hospedeiro que são maiores do que o tamanho dos poros da cápsula são excluídos 5. Aqui, nós préenviou uma abordagem à cultura e diferenciar neurônios hESC AD em um microambiente 3D usando microcápsulas de alginato. Temos modificado as condições de cultura 2 para aumentar a viabilidade do hESC encapsulado. Nós previamente mostrado que a adição de p160-Rho-associated espiral espiralada quinase inibidor (Rock), Y-27632 e fetal humano fibroblastos condicionado médio de substituição de soro (HFF-CM) para a plataforma de 3D aumentou significativamente a viabilidade de hESC encapsulado em que as células expressavam genes marcadores definitivos endoderme 1. Verificou-se agora utilizada esta plataforma 3D para a propagação de diferenciação hESC e eficiente para os neurónios DA. Análises de expressão de proteínas e do gene após a fase final de DA diferenciação neuronal mostrou um aumento da expressão de tirosina hidroxilase (TH), um marcador para neurónios DA, acima de 100 dobras após 2 semanas. Nós a hipótese de que a nossa plataforma 3D usando microcápsulas de alginato pode ser útil para estudar a proliferação e diferenciação dirigidade hESC para várias linhagens. Este sistema de 3D também permite a separação de células alimentadoras de hESC durante o processo de diferenciação e também tem um potencial para o isolamento-imune durante o transplante no futuro.
Protocol
Discussion
Vários estudos com células-tronco embrionárias de rato e células estaminais embrionárias humanas têm demonstrado os benefícios do sistema de cultura 3D em biomateriais e engenharia de tecidos 2,3. Utilizou-se microcápsulas de alginato de cálcio como uma plataforma adequada 3D para estudar a propagação de hESC e diferenciação em comparação com alginato de bário desde hESC mostrou maior viabilidade significativa quando encapsulados em alginato de cálcio do que alginato de bário. Este sistema d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Programa Bolsa NHMRC # 568969 (PSS) e Faculdade de Medicina da Universidade de New South Wales, Stem Iniciativa Cell (KSS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Notes |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter healthcare | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era Pump Systems Inc | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
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