Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee
Summary
Abbiamo ottimizzato una tecnica di microincapsulazione come una piattaforma efficace 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali per endoderma e dopaminergici (DA) neuroni. Esso fornisce inoltre l'opportunità di immuno-isolamento di cellule dall'host durante il trapianto. Questa piattaforma può essere adattato per altri tipi di cellule.
Abstract
Cellule staminali embrionali umane (hESC) stanno emergendo come una fonte alternativa per la terapia di sostituzione cellulare dal momento che possono essere espanse in coltura indefinitamente e differenziati a tutti i tipi di cellule nel corpo. Vari tipi di biomateriali sono stati utilizzati anche in colture di cellule staminali per fornire un microambiente che imita la nicchia delle cellule staminali 1-3. Quest'ultimo è importante per promuovere cellula-cellula interazione, proliferazione cellulare, differenziazione e in lignaggi specifici nonché l'organizzazione fornendo un tessuto tridimensionale (3D) ambiente 4 come l'incapsulamento. Il principio della cella incapsulamento implica l'intrappolamento delle cellule viventi all'interno dei confini di membrane semipermeabili in colture 3D 2. Queste membrane per lo scambio di nutrienti, ossigeno e stimoli attraverso le membrane, mentre gli anticorpi e le cellule immunitarie dall'host che sono maggiori delle dimensioni dei pori sono esclusi capsula 5. Qui, si preha inviato un approccio alla cultura e differenziare hESC neuroni DA in un microambiente 3D utilizzando microcapsule di alginato. Abbiamo modificato le condizioni di coltura da 2 a migliorare la redditività di hESC incapsulato. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'aggiunta di gp160-Rho-associata coiled-coil chinasi (ROCK) inibitore, Y-27.632 e fetale umano fibroblasti terreno condizionato sostituzione siero (HFF-CM) alla piattaforma 3D significativamente migliorato la redditività di hESC incapsulato in cui le cellule espresso definitive geni marcatori endoderma 1. Abbiamo utilizzato questa piattaforma 3D per la propagazione della differenziazione hESC ed efficiente ai neuroni DA. Analisi di espressione proteica e genica dopo la fase finale di differenziazione neuronale DA mostrato un aumento dell'espressione della tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per DA neuroni,> 100 pieghe dopo 2 settimane. Abbiamo ipotizzato che la nostra piattaforma 3D con microcapsule di alginato può essere utile per studiare la proliferazione e la differenziazione direttadi hESC a vari lignaggi. Questo sistema 3D permette anche la separazione di cellule feeder dal hESC durante il processo di differenziazione e ha anche un potenziale di immuno-isolamento durante il trapianto in futuro.
Protocol
Discussion
Diversi studi che utilizzano cellule staminali embrionali di topo e hESC hanno dimostrato i benefici del sistema di coltura 3D in biomateriali e ingegneria dei tessuti 2,3. Abbiamo usato microcapsule di alginato di calcio come una piattaforma adatta 3D per studiare la propagazione hESC e la differenziazione rispetto a quanto hESC alginato di bario hanno mostrato significativa redditività superiore quando incapsulati in alginato di calcio di alginato di bario. Questo sistema consente inoltre una coltura ad al…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da NHMRC Grant Program # 568969 (PSS) e la Facoltà di Medicina, Università di New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Notes |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter healthcare | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era Pump Systems Inc | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
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