Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Summary

Hemos optimizado una técnica de microencapsulación como una plataforma efectiva en 3D para la propagación y la diferenciación de células madre embrionarias para endodermo y las neuronas dopaminérgicas (DA). También proporciona una oportunidad para inmune-aislamiento de células del huésped durante el trasplante. Esta plataforma se puede adaptar para otros tipos de células.

Abstract

Las células madre embrionarias humanas) se están convirtiendo en una fuente alternativa atractiva para la terapia de reemplazo de células, ya que se puede ampliar en cultivo indefinidamente y diferenciarse a cualquier tipo de células en el cuerpo. Varios tipos de biomateriales se han utilizado también en cultivos de células madre para proporcionar un microambiente imitando el nicho de células madre ^1-3. Esto último es importante para la promoción de la célula a célula interacción, la proliferación celular, y la diferenciación en linajes específicos, así como la organización del tejido, proporcionando una tridimensional (3D) ⁴ ambiente, tales como la encapsulación. El principio de encapsulación de células implica atrapamiento de las células vivas dentro de los confines de membranas semi-permeables en cultivos 3D ^2. Estas membranas de permitir el intercambio de nutrientes, oxígeno y estímulos a través de las membranas, mientras que los anticuerpos y las células inmunes del huésped que son más grandes que el tamaño de poro cápsula se excluyen ^5. En este sentido, preenvió un acercamiento a la cultura y diferenciar hESC neuronas DA en un microambiente 3D con microcápsulas de alginato. Hemos modificado las condiciones de cultivo de ² a mejorar la viabilidad de hESC encapsulado. Anteriormente hemos demostrado que la adición de p160-Rho-asociado espiral de la bobina quinasa (ROCK) inhibidor, Y-27632, y fibroblastos de fetos humanos-medio condicionado de reemplazo de suero (HFF-CM) a la plataforma 3D mejorado significativamente la viabilidad de hESC encapsulado en la que las células expresan genes marcadores definitivos endodermo ^1. Hemos utilizado esta plataforma 3D para la propagación de la diferenciación hESC y eficiente de las neuronas DA. Análisis de proteínas y genes de expresión después de la última etapa de la diferenciación neuronal DA mostró un incremento en la expresión de la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador de las neuronas DA,> 100 veces después de 2 semanas. La hipótesis de que nuestra plataforma 3D con microcápsulas de alginato puede ser útil para estudiar la proliferación y la diferenciación dirigidade hESC a linajes diferentes. Este sistema 3D también permite la separación de células alimentadoras de hCME durante el proceso de diferenciación y también tiene potencial para inmune-aislamiento durante el trasplante en el futuro.

Protocol

Todos los procedimientos que a continuación se llevó a cabo utilizando técnicas asépticas dentro de un Gabinete de Bioseguridad Clase II. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en las tablas siguientes. 1. Preparación de 1,1% de alginato (w / v) Añadir 0,275 g de alginato sódico purificado (alto contenido en ácido glucurónico ≥ 60%, la viscosidad> 200 mPa s, y la endotoxina ≤ 100 UE / g) en un tubo estéril de 50 ml y añadir 25 ml de solución estéril de …

Discussion

Varios estudios con células madre embrionarias de ratón y hESC han demostrado los beneficios del sistema de cultivo en 3D en biomateriales e ingeniería de tejidos ^2,3. Se utilizó microcápsulas de alginato de calcio como una plataforma adecuada en 3D para estudiar la propagación hESC y la diferenciación en comparación con el alginato de bario ya hESC mostró la viabilidad significativamente mayor cuando se encapsula en alginato de calcio que el alginato de bario. Este sistema de cultivo también permit…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Notes
Alginate (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890-100G
0.9% NaCl	Baxter healthcare	AHF7123
Type J1 bead generator	Nisco engineering Inc	SPA-0447
Multi-Phaser syringe pump	New Era Pump Systems Inc	Model NE-1000
Ezi-Flow Medical Flowmeter	Gascon Systems	G0149
Y-27632	Merck	688000
Human Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	Millipore	SCR005
14G x 2” I.V. catheter	Terumo	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	For SR medium (basal)
GlutaMAX -I	Invitrogen	35050-061	For SR medium (2 mM)
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	For SR medium (20%)
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063	For SR medium (2.5 U/ml)
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)	Invitrogen	41400045	For SR medium (1x)
β-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	For SR medium (0.1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	For SR medium (5 mM)
Glasgow Minimum Essential Medium	Invitrogen	11710035	For DA neural differentiation medium (basal)
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	For DA neural differentiation medium (10%)
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360070	For DA neural differentiation medium (1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	For DA neural differentiation medium (0.1 mM)
β-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	For DA neural differentiation medium (0.1 mM)
Sonic hedgehog (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	For DA neural differentiation (100 ng/ml)
Fibroblast growth factor 8a (FGF8a)	R & D Systems	4745-F8-050	For DA neural differentiation (100 ng/ml)