Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Için basit Mikroakışkan Cihazlar Published: September 30, 2012 doi: 10.3791/3780
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Neurobiology, NCBS-TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR

Summary

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için geliştirilmiştir

Abstract

Mikro fabrikasyon akışkan cihazları küçük organizmalar üzerinde in vivo çalışmalar için erişilebilir bir mikro-ortam sağlar. Basit üretim işlemlerinde yumuşak litografi teknikleri kullanarak 1-3 mikroakışkan cihazlar için kullanılabilir. Mikroakışkan cihazlar vivo lazer mikrocerrahi 2,6 ve hücresel görüntüleme 4,7 alt hücresel görüntüleme 4,5, için kullanılmaktadır. Vivo görüntüleme organizmaların immobilizasyon gerektirir. Bu emiş 5,8 kullanılarak elde edilmiştir, konik kanalların 6,7,9, deforme membranlar 2-4,10, ek soğutma 5, anestezik gaz 11, ısıya duyarlı jeller 12, siyanoakrilat yapıştırıcı 13 ve böyle levamizol 14 gibi anestezikler ile emiş , 15. Yaygın olarak kullanılan anestezik sinaptik iletim 16,17 etkilemek ve alt hücresel nöronal ulaştırma 4 üzerinde zararlı etkileri olduğu bilinmektedir. Bu study biz böyle Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larva ve zebrafish larva gibi bozulmamış genetik model organizmaların anestezik ücretsiz immobilizasyon sağlar poli-dimetil-siloksan (PDMS) aygıtı dayalı bir membran göstermektedir. Bu model organizmalar nedeniyle küçük çaplı ve optik olarak saydam veya yarı saydam cisimlerin mikroakışkan cihazlar in vivo çalışmalar için uygundur. Gövde çapları C. erken larva aşamaları için ~ 10 mikron dan ~ 800 mikron arasında değişir elegans ve zebrafish larva ve yüksek çözünürlüklü time-lapse görüntüleme için tam immobilizasyon elde etmek için farklı boyutlarda mikroakışkan cihazlar gerektirir. Bu organizmalar, bir sıvı sütunu ile sıkıştırılmış azot gazı tarafından uygulanan ve bir inverted mikroskop kullanarak görüntülü basıncı kullanılarak immobilize edilmiştir. Tuzak salınan Hayvanlar 10 dakika içinde normal hareket döner.

Biz C. time-lapse görüntüleme dört uygulamaları göstermek elegansyani nöronların görüntüleme mitokondriyal ulaşım, nakliye kusurlu mutant, glutamat reseptör ulaşım ve Q neuroblast hücre bölünmesinde presinaptik vezikül taşınması. Bu tür filmler elde edilen veriler mikroakış immobilizasyon anestezi uygulanmış hayvanlar (Şekil 3C ve 1J 4-F) göre, hücresel ve alt-hücresel olayların in vivo veriler elde yararlı bir araçtır ve kesin olduğunu göstermektedir.

Cihaz boyutları C. farklı aşamalarında time-lapse görüntüleme sağlamak için değiştirilmiş elegans, ilk evre Drosophila larva ve zebrafish larva. Duyusal nöronlarda GFP (syt.eGFP) ile etiketlendi synaptotagmin ile işaretlenmiş veziküllerin Ulaştırma bozulmadan ilk evre Drosophila larvaları kolinerjik duyusal nöronlarda eksprese sinaptik vezikül belirteçlerin yönlü hareketi gösterir. Benzer bir cihaz ~ 30 saat sonrası fertilizasyon (HPF) içinde kalp atışı time-lapse görüntüleme yürütmek için kullanılır olmuşturlarva zebrafish. Bu veriler, geliştirdiğimiz basit cihazlar vivo çeşitli hücre biyolojik ve gelişimsel fenomenleri araştırma modeli sistemleri çeşitli uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

Protocol

1. SU8 Usta Fabrikasyon

  1. Clewin yazılımını kullanarak mikroakışkan yapıları tasarlama ve devre filmi 8 mikron asgari özellik boyutu ile 65.024 DPI lazer plotter ile yazdırabilirsiniz.
  2. Akış tabakası ve ilgili kontrol katmanı için bir gofret her; 1 dk ve deiyonize su ile durulayın için% 20 KOH yerli oksit ile 2 cm X 2 cm lik silikon gofret temizleyin.
  3. Azot gazı ile parçaları kurulayın ve 4 saat boyunca 120 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde kurutmak üfleyin. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
  4. Sıra silikon parçaları eğiren mandren bir seferde bir ve vakum açın. ~ 20 ul heksametil-disilazane (HMDS) ve ceket onları kullanarak bir sn 30 sn için 3.000 rpm ardından 5 için 500 rpm'de SPIN150 spinner. Sahip silisyum yüzeylerde Kapak
  5. SU8-2025 ~ 1.5 ml (tamamen silikon gofret Kapak http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm) ve 5 saniye boyunca 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak kat gofret 30 sn 2.000 rpm izledi. Bu, iplik protokol C larva erken aşamaları için kontrol ve akış tabakalar için uygun olan ~ 40 um kalınlıkta bir fotorezist üretir elegans.
  6. Spin ~ 5 için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak 1.5 ml SU8-2050 sn C. geç larva aşamaları için akış tabakası imalatı için uygundur ~ 80 mikron bir fotorezist kalınlık elde etmek için 30 sn 2.000 rpm izledi elegans, Drosophila / zebrafish larva ve bunlara karşılık gelen kontrol tabakaları için bazal akış katmanı.
  7. Üstüne SU8 kaplı tabakası ile sıcak plaka üzerinde silikon parçalarını yerleştirin. Yumuşak fırında 65 silikon kaplanmış parçalar ° C'de 10 dakika süreyle 95 ° C'de, ardından 1 dakika için. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
  8. SU8-2025 kaplamalı sur ile pozlama sahnede yumuşak pişmiş silikon parçalarını yerleştirinUV lamba bakan üst yüzü. C. erken larva evreleri için sırasıyla akış katmanı ve kontrol katmanı desen tasarımı I (L1, Şekil 1B) ve tasarımı II (L2, Şekil 1B) ile fotoğraf maske kullanın elegans. SU8 tabakasının üstüne fotoğraf maske yerleştirin ve maske kaplamalı katmanı karşı düz olduğundan emin olun. UV lamba deklanşör açın ve 15 saniye boyunca fotoğraf maske ile 200 Watt UV lamba yumuşak pişmiş SU8 gofret maruz kalmaktadır.
  9. C. geç larva evreleri için akış katmanı ve kontrol katmanı üretmek için (adım 1.6 hazırlanmış) SU8-2050 kaplı parçalar üzerinde tasarımı I (L1, Şekil 1B) ve tasarımı II (L2, Şekil 1B) ile fotoğraf maske kullanın elegans. (I hazırlanan SU8-2050 ile kaplı gofret üzerine Drosophila / zebrafish larvalar için sırasıyla bazal akış katmanı ve kontrol katmanı için tasarım I (L1, Şekil 1C) ve tasarımı II (L2, Şekil 1C) ile fotoğraf maske kullanınn adım 1.6). 15 sn için 200 Watt UV lamba fotoğrafı maske aracılığıyla SU8 yüzeyleri açığa.
  10. Üstüne kaplı tabakası ile sıcak bir plaka üzerinde maruz silikon parçalarını yerleştirin. 10 dakika boyunca 95 ° C'de, ardından 1 dakika süreyle 65 ° C 'de fırında gofret nakledin. Parçaları bir sonraki adıma geçmeden önce soğumasını bekleyin.
  11. 20 dakika için SU8 geliştirici çözelti kullanılarak parçalar geliştirin. Izo-propil alkol (IPA) içinde parçalar durulayın ve kuru nitrojen gazı kullanılarak darbe.
  12. Üst SU8 desen ile bir desikatör içinde silikon parçalarını yerleştirin. Tricholoro 50 ul (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 saat için bir desikatör içinde silan buhar ile kaplayın adettir.

Önlemler: KOH tedavisi, fotorezist kaplama ve gelişmekte sırasında kimyasal çalışmalar için güvenlik önlemleri alın. Silan buhar kaplama bir havalandırılan bir desikatör içinde yapılmalıdır. Koru SU8 ışığa maruz yerinden direnirler. Bir UV lig ile koruyucu gözlük kullanınht kaynağı.

2. PDMS Kalıp İmalatı

  1. Plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g Sylgard 184 taban 50 g birleştirilmesi ile 10:01 PDMS hazırlayın. ~ 3 dakika boyunca elle içeriği karıştırın. Karıştırma sırasında oluşan tüm hava kabarcıklarını çıkarmak üzere bir desikatör içinde Degas karışımı.
  2. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaşça, kontrol katmanı için, tasarım II SU8 deseni ile silikon gofret üzerinde 5 mm kalınlığında PDMS karışımı dökün. Kabarcıklar halinde bütün kabarcıklarını çıkarmak için düşük vakum içinde SU8 model üzerinde, gazdan arındırmak PDMS dökme sırasında oluşur.
  3. Spinner mandrenin, akış katmanı için, tasarım I SU8-2025 modeli ile silikon gofret yerleştirin ve onları tutmak için vakum açın. ~ 1 PDMS karışımı ml ve kat 5 için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak gofret gofret örtün sn 30 sn için 1.500 rpm izledi.
  4. Coat ~ tasarımı I (L1, Şekil 1B) SU8-2050 model 80 mikron ile silikon gofret 1 ml PDMS karışımı içinC. geç larva aşamaları için akım katmanı 5 saniye için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak elegans 30 sn için 1.000 rpm izledi. Coat 35 sn için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak Drosophila / zebrafish larvalar için akış katmanlı tasarımı I (L1, Şekil 1C) SU8-2050 modeli ile silikon parçaları üzerinde PDMS karışımı kalın bir tabaka.
  5. Tasarım Bake PDMS kaplamalı silikon parçaları I ve kontrol katmanı için uygun tasarım II ile gofret C için PDMS içeren 50 bir sıcak hava konveksiyon fırında elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva ° 6 saat boyunca C.
  6. C. için SU8 desen II içeren silikon substrat PDMS parça kesip elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva keskin bir bıçak kullanarak. Harris bir zımba kullanarak PDMS kalıp içinde ana tutucu bağlantı rezervuar üzerinde ~ 1 mm çapında küçük bir delik.
  7. Delikli PDMS blok (kontrol için 40 mikron kalınlığında kalıp içeren yerleştirinyukarı bakacak şekilde kontrol tabakası ile kalıplanmış yan tepsi üstünde bir plastik tabaka L2). PDMS kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde, aynı tepsiye 40 mikron kalınlığında SU8 tasarımı I içeren PDMS kaplı silikon gofret yerleştirin. Plazma temizleyici hücresinde tepsisini takın ve 2 dakika süreyle vakum açın. Daha sonra, plazma gücü açın ve odanın rengi açık pembe olana kadar odasının basıncını düşürebilir. 2 dakika için düşük vakum altında 18 Watt hava plazma için her iki yüzey Açığa.
  8. C. geç larva evreleri için kalın SU8 usta içeren deseni II 80 mikron kaldırılır yumrukladı PDMS blok yerleştir yukarı bakacak şekilde kontrol tabakası ile kalıplanmış yan tepsi üstünde bir plastik ya da elegans Drosophila / zebrafish larva. Daha sonra C. I 80 mikron kalınlığında tasarımı içeren silikon gofret üzerine kaplanmış gelen pişmiş PDMS katmanı sıkma yerleştirin elegans aşamalarında veya düz PDMS kaplı s ile aynı tepsiye aynı anda Drosophila / zebrafish larvaurface yukarı bakacak. Aynı protokolü kullanın plazma hava almaları için yukarıda.
  9. C. için iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirin elegans ve / ya da birlikte hafif bir basınç ve 2 saat boyunca 50 ° C 'de bu sıcak hava konveksiyon fırını içinde fırında ile Drosophila / zebrafish larvası.
  10. C. için SU8 tasarımı ile silikon substrat gümrüklü cihazlar Kes elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva. Punch erişim akış kanal giriş ve çıkış depoları delikler.
  11. C. için bir plastik tepsi üzerinde gümrüklü PDMS kalıp yerleştirin yukarı bakacak akış katmanlı tasarım kalıp tarafı elegans. Temiz cam kapak kayma (22 X 22 mm, No 1 kalınlığı) ve aynı plastik tepsi üzerine yerleştirin. PDMS kalıp ve plazma odasının iç cam kapak kayma içeren kaseti takın. Alt cihazın PDMS yüzey ve cam kapak slipi ila 18 2 dk için düşük basınç altında Vat hava plazma Açığa. Gen ile iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirinTLE basınç ve 2 saat boyunca 50 ° C 'de bu sıcak hava konveksiyon fırını içinde fırında.
  12. Ileride kullanmak üzere temiz bir ortamda cihazı saklayın.

3. Drosophila / Zebra balığı Cihaz için ek adımlar

  1. Temiz bir cam yüzey boyutu 2 cm tricholoro 50 ul ile x 2 cm (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 2 saat için bir desikatör içinde silan buhar. Açığa
  2. Spin ~ 35 sn için 500 rpm'de SPIN150 eğiren kullanarak Silanlanmış cam yüzey üzerinde adım 2.1 'de hazırlanan 10:01 PDMS karışımı 1 ml. Yukarı bakacak kaplamalı yüzey 6 saat boyunca 50 ° C sıcaklıkta sıcak hava fırında PDMS kaplı cam yüzeyler pişirin. PDMS katmanı sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz.
  3. Punch PDMS ayırıcı tabaka oluşturur, PDMS ortasında özel yapılmış bir keskin metal zımba kullanarak kaplı tabaka. Metal zımba şekli, Drosophila / zebrafish için akış tasarımı (L1, Şekil 1C benzer tasarlanmıştır
  4. PDMS ara katman ve düşük vakumlu plazma temizleyici kullanarak tek gümrüklü blok (Drosophila / zebrafish larvaları için adım 2.9 'da yapılan akışı katman ve kontrol katmanı), 18 Watt hava plazma maruz. Birlikte iki plazma muameleye tabi olan yüzeylerde yerleştirin ve 50 bir sıcak hava fırın ° C'de 2 saat boyunca bunları fırında.
  5. Cam gümrüklü cihaz kesin, giriş ve çıkış depoları ve adım 2.11 'da belirtildiği gibi bir plazma temizleyici kullanarak cam bir kapak kayma (22 X 22 mm, 1 Nolu kalınlık) tahvil ona yumruk erişim delikleri. Bu ~ 500 mikron bir kanal yüksekliği ile ilk evre Drosophila larvaları için bir immobilizasyon cihaz üretecek. Zebra balığı larvaları için, ek bir bağ adım PDMS ara katman üretim süreci çoğaltabilirsiniz. PDMS-S ikili tabaka 30 HFP zebrafish larvaları için 900 um arasında bir kanal yüksekliğini üretir.

Önlemler: Cihaz üretim sırasında toz parçacıkları kaçının. İki plazma yüzey temizliğilar uygun bağların için ücretsiz tamamen toz olması gerekir. Özel bir temiz oda cihazları içinde toz parçacıklarının birikimi en aza indirmek için uygun olmadığı durumlarda bir desikatör içinde cihazları saklayın.

4. PDMS membranı kullanılarak

  1. 18 gauge iğne (dış çap ~ 1,25 mm) sayesinde basınçlı azot gazı kaynağı regülatör ve ana tuzak rezervuar diğer ucunu bir mikro-flex boru (iç çapı ~ 1.6 mm, dış çapı ~ 4.8 mm) bir ucunu tüp yapıştırılmış. Boru bağlantısının orta kullanılan bir 3-yollu musluk zar üzerinde uygulama ya da basınç serbest bırakma sağlar.
  2. Bir C. ana tuzak rezervuar bağlamadan önce distile su ile 10 cm kolon PDMS cihaza bağlanmış boru Dolgu elegans ve / veya Drosophila / zebrafish larva cihaz.
  3. 14 psi ve okuma inci yönünde saptırma ana tuzak zar izlemek için azot tedarik vanayıbir inverted mikroskop düşük büyütmede e akış kanalı. Mikro-flex tüp içinde su kolonunun 3 yollu musluk açık olduğunda sıkıştırılır. Deflected membran kenarları iletilen ışık (Şekil 1I ve 1J) görülebilir. Membran saptırma PDMS membran altında toz parçacıkları / kabarcıklar değiştirme nedenleri ve kanal sınırları onları iter.
  4. Sıvı ön sıkışan hava olmadan tamamen mikrokanal doldurur kadar bekleyin.
  5. Onun dinlenme pozisyonu için zar rahatlamak için 3-yollu musluk kullanılarak basınç serbest bırakın.

5. C. takma elegans, Drosophila ve Zebra balığı Cihaz içine Larva ve Esnek PDMS Membran altında Onları Hareketsizleştirici

  1. M9 tampon ile akış kanalı doldurun [3 g KH 2 PO 4, 6 gr Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, 1 L H2O, aut ile sterilizeoclaving] C için elegans 18 ya da 1X PBS bir 10 dakika süreyle daha önce Drosophila / zebrafish larvaların 19 [8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 gr Na 2 HPO 4, 0.24 g KH 2 PO 4, H2O 1 L için, otoklav ile sterilize] deney.
  2. Tek bir C. bulun düşük bir büyütme stereo mikroskop kullanılarak NGM plaka 18 gerekli sahne elegans (veya agar yumurta plaka veya sıvı ortamda 20 elle dechorionated 30 hpf zebrafish larva ilk evre Drosophila larvaları). Bir mikro ucu içine tampon solüsyonunun küçük hacimli kullanarak tek bir hayvan seçin. Sonuna bir mikro ucu kullanın büyük Drosophila veya arabellekte zebrafish larva karşılamak için kesti.
  3. Akış kanalı giriş aracılığıyla tek bir organizma itin. Ana tuzak altında bireysel hayvan konumlandırmak için pipetleme basıncını ayarlayın.
  4. Yavaş yavaş kanal karşı hayvan konumlandırmak için PDMS membran basınç artışınel sınır ve C için 14 psi basınç ile hareketsiz elegans, Drosophila ve zebrafish larvaları için 3 psi 7 psi.
  5. Görüş mikroskobik alanının merkezinde immobilize hayvan yerleştirin. Yüksek çözünürlüklü parlak alan veya floresan görüntüleme için istenen ayarları bir inverted mikroskop kullanın. Önceden kare hızında tek veya time-lapse floresans görüntüler elde edin.
  6. Tuzak basıncı bırakın ve düşük büyütmede 5-10 dakika süreyle hayvan lokomosyon izlemek.
  7. Hayvan yıkayın ve yukarıdaki adımları tekrarlamanız taze hayvan yerleştirin.
  8. Bir şırınga kullanılarak uygulanabilir distile su kullanılarak atık rezervuar tüm hayvanlar yıkayın. Gelecekte yeniden kullanım için bir şırınga kullanarak hava basarak kanal kurulayın.

Önlemler: ana kanal içindeki akış yüksek pipetleme basınç gerektiren Hayvanlar tuzaktan yayımlanmasından sonra kötü lokomosyon / sağlık göstermek eğilimindedir ve ima için kaçınılmalıdırging. Kristaller tarafından kanalın tıkanmasını önlemek için tampon herhangi bir iz için akış kanalı temizleyin. Yağ, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılması durumunda, daha sonraki deneyler için gürültü oranı iyi bir sinyal vermeye devam edebilmek için cam kapak slipi temizleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir akış katmanda (Layer 1) ve bir kontrol katmanı (Katman 2) Şekil 1'de gösterildiği gibi: immobilizasyon cihazı bağ iki tabaka tarafından uydurulan bir bilayeri PDMS bloğudur. Ana tutucu bir regülatör ve bir sıvı kolonu (Şekil 1A) vasıtasıyla zar üzerine gerekli (3-14 psi) basınç uygulamak için bir 3-yollu kapama vanası yoluyla bir nitrojen gaz silindiri ile bağlanır. Deflected membran C. durağanlaştırır Farklı boyutları (Şekil 1B ve 1C) ile tasarlanmış akış kanalında elegans, Drosophila veya zebrafish larva. Fotoğraf maskeleri C. için farklı geometriler ile immobilizasyon cihazı katmanları tasarlamak için kullanılır elegans (Şekil 1D), Drosophila larvaları (Şekil 1F) ve zebrafish larvaları (Şekil 1G). Akış tabakası (Şekil 1E içinde h1, 1K) kanal yüksekliği veya karşılamak için farklı spin kaplama hızları kullanarak değişmiştirakış kanalı içine, farklı çaplardaki organizmaların. Akış katman yükseklikleri 40 mikron, 80 mikron, 500 mikron ve C için 900 mikron az uyduruldu elegans larva evreleri, yetişkin C. sırasıyla elegans, ilk evre Drosophila larva ve zebrafish larva (Tablo 1). 40 um arasında bir akış kanalı yüksekliğe sahip cihaz L1 ve erken L4 C uygundur elegans larva. 80 um akış kanalı yüksekliği olan bir cihaz geç L4 larva ve yetişkin C için kullanılır vulva çıkıntı başladığında elegans. Geniş zebrafish cihazlar da büyük Drosophila larvalarının için de kullanılabilir. PDMS membran kalınlığı (m) C için 40 mikron ve 300 mikron de uydurmadır sırasıyla elegans ve Drosophila / zebrafish cihazlar. 2. katmanda mikroakışkan kanal yüksekliğini C larva erken aşamaları için 40 um de üretildi C. geç larva aşamaları için elegans ve 80 mikron elegans ve Drosophila/ Zebrafish larva. Akış kanalı, membran ve kontrol kanal yüksekliğini çoklu bağımsız yığın olarak imal edilmiş cihaz içinde ölçüldü ve birbirine göre ± 5 mikrometre dahilinde uyumlu olduğu bulunmuştur. Cihaz, akış kanalı içinde organizmaların immobilize etmek için bir yöntem zar sapma (Şekil 1 H-J) kullanır.

Organizmalar Akış kanalı (PDMS-1) Akış kanalı için koşullar Spin Spacer PDMS (PDMS-S) Boşluk PDMS için Spin koşulları İmmobilizasyon basıncı (psi)
C. elegans (L1 erken L4) 40 mikron (SU8-2025) 500 rpm (5 sn), 2.000 rpm (30 sn) NA NA 14
C. elegans (geç L4 ve yetişkin) 80 Μ m (SU8-2050) 500 rpm (5 sn), 2.000 rpm (30 sn) NA NA 14
Drosophila (ilk evre) 80 mikron (SU8-2050) 500 rpm (5 sn), 2.000 rpm (30 sn) 400 mikron (PDMS) 500 rpm (35 sn) 7
Zebra balığı (30 HPF) 80 mikron (SU8-2050) 500 rpm (5 sn), 2.000 rpm (30 sn) 400 mikron (PDMS) 2X 500 rpm (35 sn) 3

Akış kanalı (PDMS-1) ve ara tabaka PDMS (PDMS-S), Tablo 1. Cihaz boyutları C de ikinci elegans ve Drosophila / zebrafish cihazlar.

C. elegans L4 larva 14 psi azot gazı (Şekil 2A) kullanılarak 80 mikron kanal yüksekliği PDMS mikroakışkan cihaz içinde immobilize edildi. Time-lapse floresans görüntüleri wmitokondri görüntüleme ulaşım için 60X objektif (sayısal diyafram 1.4, yağlı objektif) kullanarak saniyede 2 kare hızı (fps) iktisap ere dokunmatik reseptör nöronları 21 bir mitokondrial matriks hedef GFP kullanarak görüntülendi. Tüm 400 kare ImageJ (kullanarak kymographs dönüştürülmüştür www.rsbweb.nih.gov / ij ) ve mitokondri (Şekil 2E) anterogradely, (away hücre gövdesinden) yönettiği retrograd yönetti (hücre gövdesi doğru) veya sabit olarak sınıflandırıldı. Biz immobilizasyon basıncı 21 psi mitokondriyal ulaşım kadar gözlendi, ancak akı düşük immobilizasyon basınç biraz fazla idi. Mitokondri anterograd ve retrograd akı 0.8 ± 0.25 ve 1.2 ± 0.34 14. psi immobilizasyon basıncı ise 7 psi 1.1 ± 0.23 ve 1.6 ± 0.22 olarak ölçüldü. Değerleri 1.1 istatistiksel olarak farklı değildi ± 0.33 ve 1.3 ve plusmn; 0.42 hayvanlardan elde edilen 3 mM levamisol (p-değeri> 0.45, n = 30 hayvan) kullanılarak immobilize.

500 mikron yüksekliğindeki daha büyük bir cihaz birinci instar Drosophila larvalarının (Şekil 2B) ve HPF zebrafish 28-30 larva (Şekil 2B) hareketsiz hale getirmek için de kullanılabilir. İlk larva dönemlerinde Drosophila larva diseksiyonu zor olabilir. Buna mikroakışkan cihazları yüksek çözünürlüklü parlak alan ve / veya bozulmamış organizmalarda kullanarak floresan görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem sağlar. Bireysel Drosophila larvaları (Şekil 2C) edinilen duyusal nöronlarda 7 sıkıştırılmış azot gazı psi (Şekil 2B, Tablo 1) ve synaptotagmin.eGFP ulaşım floresans görüntüleri kullanılarak immobilize edildi. Time-lapse film duyu nöronlarının (Şekil 2F) hareketli ve sabit synaptotagmin belirgin kargo gösterdi. Ortalama anterograd ve retrograd hız kym ölçüldüographs 0.92 ± 0.04 mikron / s ve 1.00 ± 0.05 mikron / s (n = 6 hayvan, n> 40 segment) olmak. Bu anterogradely (0.84 ± 0.05 mikron / s) ve retrograd (0.76 ± 0.03 mikron / s) 22 hem hareketli disseke Drosophila motor nöronlar ölçülür synaptotagmin taşıyan ulaşım veziküllerin hızları ile karşılaştırılabilir.

900 mikron yüksekliğindeki Benzer cihazlar zebrafish larvaları (Şekil 2B, Tablo 1) farklı aşamalarında hareketsiz hale getirmek için kullanılmıştır. Erken gelişim evrelerinde Zebra balığı larvaları kendi kuyruğunu her 10 ila 15 sn çevirir ve genellikle çözelti içinde veya yüksek çözünürlüklü görüntüleme 23 için montaj medya 0.02% tricaine (MS-222) kullanılarak immobilize edilmiştir. Bizim PDMS cihaz hızlı immobilizasyon için alternatif bir yol sağlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme 24 sırasında optik yol güvenilmez bir montaj orta ihtiyacını ortadan kaldırır. Biz elle 28-3 dechorionated0 hpf larva ve larva kalp atışı time-lapse film elde etmek için 3 psi azot gazı kullanarak PDMS cihazda ayrı ayrı immobilize. Kalp atışı hızı 136.8 olarak ölçüldü ± min (n = 8 film) başına 1.6 ve diğer yayınlanmış raporları 25 benzerdir.

Bizim basit Mikroakışkan cihaz zaten vahşi tip C alt hücresel ve hücresel olayları çeşitli ölçmek için gösterdiği olmuştu elegans 4. Bizim mikroakışkan cihaz, vahşi tip C olarak elegans gibi anestezikler kullanılarak immobilize olan hayvanlara kıyasla nöronların hareket sinaptik veziküller olarak kargo daha büyük bir sayı gösterir. Ancak, bu bulgular doğru tutun görmek için mutant hayvanlar için bizim cihazlar test değil. Bunu sınamak için biz pre-sinaptik veziküller 26 nakil kinesin3 / UNC-104 moleküler motor, unc-104 (e1265), güçlü bir hypomorphic mutant kullanılır. Bu GFP akı :: RAB-3 işaretli ön sinaptik vesi karşılaştırıldığındaön yan mechanosensory immobilize anestetik nöronlar ve aygıt içinde cles mutant aniamls (Şekil 3A) immobilize. Presinaptik vezikül Akı 1 mM levamizol (Şekil 3B, 3C) 27 anestezi unc-104 hayvanlardan elde edilen verilere göre cihaz immobilize hayvanlarda yüksek akı oldu. Bu mikroakışkan cihazlarda görüntüleme güçlü ulaşım kusurlu mutantlar veri toplama daha verimli bir araç olma olasılığı olduğunu gösterir. Biz de URY nöronlar glutamat reseptörlerinin diğer kargo örneğin dendritik taşımacılığı (Şekil 3D, 3E) aygıtı immobilize hayvanlarda imaged edilebileceğini göstermektedir. Cihaz, aynı zamanda ilk C. sırasında görüntü hücresel işlemleri için de kullanılabilir Böyle L1 hayvanlarda Q neuroblast bölümü olarak elegans gelişimi. QR hücre ile tutarlı yumurtadan sonra iki yavru hücreye QR.a ve QR.p ~ 3 saat (Şekil 3F) oluşturmak üzere bölmek için görüntülendiönceki gözlemler 28.

Akış kanalı (PDMS-1) ve ara tabaka PDMS (PDMS-S), Tablo 1. Cihaz boyutları C de ikinci elegans ve Drosophila / zebrafish cihazlar.

Şekil 1
Şekil 1. Genetik model organizma için PDMS mikroakışkan cihazlar şematik gösterimi. (A) organizma akış kanalı içine bir mikro ucu kullanılarak yüklenen ve bir regülatör ve vana ile kontrol sıkıştırılmış azot gazı kullanılarak immobilize edilir. Cihaz bir inverted mikroskop aydınlık alan / floresan görüntüleme için uygundur. Dizayn C. için sırasıyla 10 mm uzunluğunda bir akış kanalı (tasarım I, L1) ve bir kontrol kanalı (tasarımı II, L2) oluşan elegans (B) ve Drosophila / zebrafish larva (C). Boyutları tasarım (B ve C) gösterilir. Variou (D, F, G) ŞematikPDMS (PDMS-1, PDMS-2, PDMS membran, PDMS-S ve Cam) s tabakalar bir C de mevcut elegans, Drosophila ve zebrafish immobilizasyon cihazı. Eklemek için esnek bir zar ve bir ayırıcı tabaka PDMS (PDMS-S) oluşturmak için yığın PDMS tabaka (PDMS-2), bir dönme kaplanmış tabaka PDMS (PDMS-1) gösteren cihazın bir çapraz kesit bölgesinin (E) şematik gösterimi akış kanalı yüksekliği (Drosophila / zebrafish cihaz için). Tüm yapı organizma (kahverengi daire) karşılamak için bir optik dereceli cam kapak kayma geri dönüşümsüz olarak yapıştırılır. Şematik kontrol kanalı 'h2' yüksekliği, akış kanalı 'h1', delikli ara katman 's' ve membran kalınlığı 'm' gösterir. (H) kontrol kanalındaki basınç altında sıvı kolon varlığında akış kanalına doğru zar sapma gösterir. Parlak saha görüntü sıfır altında bir serbest (I) ve bükülmesi membran (J) gösterilmiştir ve 14 psi sırasıyla sıvı kolon basınçlı hale gelirler. Ok ve ok ucu kabarcık u gösterirsırasıyla akış kanalı içinde membran nder ve dışarı. C. (K) kesit görüntüsü elegans cihaz sabitleme alanı yerde alınmıştır. Ölçek çubuğu 50 mikron (K) ve 200 mikron (I, J) 'dir. (D, F, G) Şemalar ölçekli değildir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Görüntüleme genetik model organizma bir mikroakışkan cihaz immobilize. Bir immobilize C. Aydınlık alan görüntüsü elegans (A), bir PDMS mikroakışkan cihazın bir birinci instar Drosophila larvalarının (B) ve bir 30 HPF zebrafish larvaları (D). JsIs609 of time-lapse görüntüleme, bir C. kymograph analizi Bir aygıt immobil bir anterior lateral mechanosensory nöron (ALM) bir mitokondrial matriks hedef GFP ifade elegans zorlanma,uzaklaşmış hayvan (E). Mitokondri kymograph içinde anterograd ('aşağı' ok başı), retrograd ('up' ok başı) ve durağan ('yıldız' işareti) olarak sınıflandırılır. Bozulmamış bir ilk evre Drosophila larva (C) Floresans görüntüsü. Kutu syt.eGFP taşıma yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme bir kolinerjik nöron içinde gerçekleştirilir lokasyonuna işaret eder. Çerçeve numaraları ile 5 Hz iktisap beş kare Montajı Montaj (F), anterograd retrograd ve kırtasiye gibi gösterilen her görüntü ve GFP işaretli kargo gösterilir. (D) kutusunun zebrafish larva kalp hızının hesaplanması için izlenmiştir alanı gösterir. Ölçek çubuk 5 mm (F), 10 um (E), 100 um (A, B) ve 200 mikron (D) 'dir.

Şekil 3
Şekil 3. C. hücresel ve hücre altı görüntüleme PDMS mikroakışkan cihazlar kullanarak elegans. Bir karınca (A) Şematikanterograd ve retrograd yönleri ile erior yanal mechanosensory (ALM) nöron işaretlenir. Noktalı kutu aksonal transport için görüntülü bölgeyi gösterir. 350 kare sol sağ ve sinir halkası (NR) üzerine hücre gövdesi (CB) ile 5 fps hızda dönen bir disk konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. Veriler bir aygıt içinde immobilize hayvanlar için kymographs kullanılarak ya da 1 mM levamisol (C) kullanılarak analiz edilmiştir. Anterograd ve retrograd yönde hareket Kargo sırasıyla 'aşağı' ve 'yukarı' işaret eden oklar kullanılarak gösterilmektedir. 350 time-lapse karelerin üzerine ALM nöronun 20 mikron bölgede unc-104 (e1265) Hayvanlarda gözlenen parçacıkların (B) anterograd ve retrograd akı. (D) görüntü GFP için kullanılan bir URY nöronun şematik glutamat reseptörleri ulaşım işaretlenir. 350 time-lapse çerçeveleri PDMS cihaz immobilize hayvanlarda anterograd ve retrograd yönde hareket veya 1 mM levamizol (E) kullanarak kargo göstermek kymographs dönüştürülür. Q neuroblast di sırasında edinilen Time-lapse görüntülerC. erken larva dönemlerinde görme ve göç elegans. (F) QR geçiren bölümü göster Üç time-lapse çerçeveleri yavru hücrelere QR.a ve QR.p. oluşturmak için Ölçek çubuğu 5 mikron (C, E ve F) 'dir. (B) 'de gösterilen veriler ortalama ± SEM edilir (n> 4). Karşılaştırmalar anestezik edilen değerlere göre yapılır ve ile gösterilir * (p <0.05) ve ** (p <0.005).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PDMS microfluidic cihazlar bu nedenle herhangi bir yarı saydam / şeffaf model organizma ve in vivo görüntüleme yüksek çözünürlük için kullanılan optik olarak transparan vardır. Bizim tasarım bozulmadan canlı hayvan hücresel ve alt hücresel olayların yüksek büyütme uzay-zamansal görüntüleme için uygundur. Yumuşak litografi teknikleri kullanarak Mikro ve model organizmaların çeşitli boyutlar için cihaz boyutları kolay manipülasyon sağlar. Çeşitli büyüklüklerde aygıtlar C. farklı aşamaları için üretilmişlerdir elegans, Drosophila larva ve zebrafish larva. Kendi akışı tabaka kanallarda 40 mikron ve 80 mikron farklı yüksekliklere sahip cihazlar geliştirilmiş immobilizasyon ve daha sonra her iki (L1) erken ve daha iyi sonrası görüntüleme sağlık (geç L4) C. aşamaları gösterir sırasıyla elegans. Biz C. için cihaz üretiminde% 100'lük bir başarı oranı elde tüm arızalı cihazlar olmadan elegans ve Drosophila / zebrafish. Cihazlar kadar birden çok kez kullanılabilirkontrol kanalı toz partikülleri ya da bakteri büyümesi ile kirlendiğini kestirilebilir. Cihaz C. immobilize elegans anesteziye hayvanlara kıyasla vahşi tip ve mutant hayvanlarda hem de daha büyük bir yük akı göstermektedir. Cihaz immobilizasyon Özellikle Drosophila larva 29 erken gelişim aşamaları için teknik olarak zor diseksiyonu protokolleri için gereksinimini ortadan kaldırır.

PDMS microfluidic cihazlar Ani hareketsiz hale getirme protokolleri dıştan uygulanan bir anestetik için gereken tipik olarak daha uzun etki süreleri ile karşılaştırıldığında deney süresi azalır içsel bir avantajı vardır. Tüm immobilize organizmalar deforme PDMS membran üzerindeki basınç yayımlanmasından sonra 5-10 dakika içinde normal hareket döner. C. elegans akış kanalı ve uzak immobilizasyon membranın merkezi kısmı arasında sınır immobilize edilir. Akış kanalının ortasına ve immobilize Hayvanlar kötü sağlık sonrası immobiliza göstermektion ve bir veya iki gün içinde ölür. Bizim Mikroakışkan cihaz L4 aşamada C. tutmak için kullanılır olmuştur elegans onun sağlık veya sonraki gelişimi etkilemeden membran altında bir saat kadar hareketsiz. Daha kısa sürelerde (10 dk) için immobilize Hayvanlar görüntüleme için birden çok kez kalmış olabilir. Erken gelişimsel aşamaları için, C elegans uzun vadeli time-lapse deneyleri (~ 3 saat) için biraz daha düşük basınçlı (7 psi) ile immobilize edildi. Membran tahliye sonrası altında immobilize Hayvanlar Aradan zaman aynı cihaz kalmıştı. Bu hayvanlar kendi gelişimi ve genel sağlık hem de vahşi tip karşılaştırılabilir. Yetişkin C. düşük basınçta (7 psi) ile immobilize elegans yüksek çözünürlüklü time-lapse deneyler sırasında yavaş kayma gösterdi ve ulaşım analizi için karmaşık analiz araçları gerektirir. Ancak düşük basınçlarda gibi ~ 3 saat veya yarı kantitatif mitoch fazla Q neuroblast hücre bölünmesi / göç gibi daha uzun vadeli çalışmalar gerçekleştirmek için kullanılanondria ulaşım karakterizasyonu; tam immobilizasyon gerekmez süreçleri. Immobilizasyon Böylece düşük basınçta alınması gerektiğini veri kümesi bağlı olarak kullanılabilir.

L4 C. Time-lapse görüntüleme elegans diğer model sistemler 30-32 nöronlar için rapor edildiği gibi GFP sıçrayan hareket ALM nöron (zorlanma jsIs609) mitokondri işaretlenmiş gösterir. Bunların çoğunluğu filmin süresi boyunca sabit ise bu nöronların bazı mitokondri çift yönlü ulaşım göstermektedir. Biz C. durumunda 14 psi basınç immobilizasyon kullanmaya devam akı küçük farklılıklara rağmen, elegans tam immobilizasyon elde etmek ve aksonal transport yüksek çözünürlüklü time-lapse görüntüleme sırasında herhangi bir kayma önlemek için. Biz genel bir protokol 14 psi kullanarak ve bu artma veya azalma olabilir deneysel gereksinimlerine bağlı olarak göstermektedir. Hayvanlar Normal locomotio dönmek için yaklaşık aynı zaman aldın alt ve üst immobilizasyon basınçları ve immobilize hayvanlar hem immobilizasyon olmaksızın yetiştirilen olanlarla aynı geliştirdi.

Ayırıcı tabaka ile daha büyük bir boyut kullanılarak üretilen cihaz bu tür Drosophila ve zebrafish larvaları gibi daha büyük bir model organizma için de kullanılabilir. Bozulmamış ilk evre Drosophila duyusal nöronlarda synaptotagmin.eGFP ulaşım Görüntüleme anterograd ve retrograd iki yönde de aktif taşıma görülmektedir. Cihaz immobilize larvaları ölçülen ortalama hız daha yüksek bir parçalanmış, motor nöronlar 22'de ölçülen değerler ile karşılaştırılır. Bu fark daha hızlı bizim deneylerinde veri toplama (5 hz v / s 1.1-1.4 Hz), organel taşıma (duyu v / s motor nöronları) ve / veya diseksiyonu nedeniyle etkileri nöron spesifik farklılıklar ortaya çıkabilir.

Bizim ön deneylerle böylece biz belirlenir, vahşi hayvanlara 4 münhasıran yürütülmüştür olmadığınıMikroakışkan cihazlarda görüntüleme mutantlar da avantajlı oldu. C. Time-lapse görüntüleme elegans L4 hayvanların GFP akı :: RAB-3 işaretli ön sinaptik kesecikler 1.0 mM levamisol immobilize kinesin3/unc-104 mutantlar olarak bizim PDMS cihaz (Şekil 3B) ile immobilize edilen hayvanlarda elde edilen akış ölçümleri ile karşılaştırıldığında azaltılmış gösterir. Biz sık sık gözlenen ve hayvanlar vahşi hayvanlara hareketsiz anestezik konsantrasyonları kullanılarak immobilize eğer mutantlar çok az ulaşım gözlenmektedir bir örnek (Şekil 3C) göstermek var. Unc-104 hayvanlarda hareket veziküllerin sayılarını mikroakışkan cihazlar kullandığınızda oldukça yüksektir. PDMS membran (Şekil 3B) uygulanan 14psi zaman basınç altında tutulacakları anestezi altındaki hayvanlarda benzer taşıma özellikleri göstermektedir. Benzer gözlemler vahşi hayvanlara 4 yapılmıştır. Bu veriler artan akı im kaynaklanabilecek olası değildir düşündürmektedirazot altında seferberlik, ancak hücre içi ulaşım için daha az zarar verici bir protokol yüzünden.

Prensip olarak, örneğin kalsiyum dinamikleri ve hücre bölünmesi gibi diğer olayları her yanı bozulmadan Drosophila / zebrafish larvaları görüntülenebilir. Cihaz immobilize hayvanların Post-görüntüleme kurtarma organizma canlılığını 4 daha az zararlı ve böylece bu tür cihazları da uzun zaman ölçeğindeki meydana gelen olayları için genetik model genetik organizmalar uzun vadeli görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılır olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz C. için nuIs25 ve CGC için, bir Drosophila kafes korumak için Drosophila stok, Tarjani Agarwal Peter Juo Dr Krishanu Ray ederim elegans suşları. SPK Michael Nonet laboratuvarında jsIs609 yaptı. Biz mikroakışkan cihazlar jsIs609 hayvanların mitokondri ulaşım time-lapse görüntüleme onun yardım Arpan Agnihotri (BITS Pilani) teşekkür ederim. Biz zebrafish embriyolar bize sağlamak için Dr Vatsala Thirumalai ve Surya Prakash minnettarız. Biz Nanoteknoloji (No SR/55/NM-36-2005) Bilim ve Teknoloji-Merkezi Başkanlığı tarafından desteklenen dönen diske konfokal mikroskop kullanımı için NCB'ları Dr Krishna ve CIFF ederim. Biz de tartışmalar için Kaustubh Rau, V. Venkatraman ve Chetana Sachidanand ederim. Bu çalışma DBT doktora bursu (SM), DST fast-track düzeni (SM) ve bir DBT hibe (SPK) tarafından finanse edildi. SA SPK DST ve CSIR bağışları ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafers University wafer 150 mm (100) Mech Grade SSP Si
Clewin Software WieWeb software Version 2.90
Laser plotter Fine Line Imaging 65,024 DPI
HMDS Sigma-Aldrich 440191-100ML
SU8 Microchem SU8-2025, SU8-2050
Developer Microchem SU8 Developer
Silane Sigma-Aldrich 448931-10G
PDMS Dow corning Sylgard 184
UV lamp Oriel 66943 200W Hg Oriel Light
Hot air oven Ultra Instruments Custom made Set at 50 °C
Hot plate IKA Laboratory Equipment 3810000 http://www.ika.com
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Spinner Semiconductor Production Systems SPIN150-NPP www.SPS-Europe.com
Glass cover slip Gold Seal 22 X 22 mm, No. 1 thickness
C. elegans Caenorhabditis Genetics Center (CGC) e1265, ayIs4
Drosophila Bloomington P{chaGAL4}/cyo, UAS-syt.eGFP
Zebrafish Indian wild type Wild type
Tygon tube Sigma Z279803
Micro needle Sigma Z118044 Cut into 1 cm pieces
3-way stopcock Sigma S7521
Harris puncher Sigma Z708631
Compressed nitrogen gas Local Gas supplier Use a regulator to control the pressure
Stereo microscope Nikon SMZ645
Confocal microscope Andor Olympus Yokogawa spinning disc confocal microscope
ImageJ National Institutes of Health www.rsbweb.nih.gov/ij Java based image processing program

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  2. Guo, S. X. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).
  3. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5, 1888-1902 (2010).
  4. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12, 372-385 (2011).
  5. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nat. Methods. 5, 637-643 (2008).
  6. Allen, P. B. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. J. Neurosci. Methods. 173, 20-26 (2008).
  7. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
  8. Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F. Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13891-13895 (2007).
  9. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab Chip. 7, 1515-1523 (2007).
  10. Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation. Lab Chip. 8, 653-656 (2008).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9, 151-157 (2009).
  12. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
  13. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  14. Snow, J. J. Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons. Nat. Cell Biol. 6, 1109-1113 (2004).
  15. Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95, 905-928 (1980).
  16. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nat. Neurosci. 2, 791-797 (1999).
  17. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 140, 363-376 (2005).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  19. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
  20. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 153, 91-98 (2011).
  21. Fatouros, C. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Hum. Mol. Genet. , (2012).
  22. Barkus, R. V., Klyachko, O., Horiuchi, D., Dickson, B. J., Saxton, W. M. Identification of an axonal kinesin-3 motor for fast anterograde vesicle transport that facilitates retrograde transport of neuropeptides. Mol. Biol. Cell. 19, 274-283 (2008).
  23. Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Lab. Anim. (NY). 35, 41-47 (2006).
  24. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  25. Stainier, D. Y., Lee, R. K., Fishman, M. C. Cardiovascular development in the zebrafish. I. Myocardial fate map and heart tube formation. Development. 119, 31-40 (1993).
  26. Hall, D. H., Hedgecock, E. M. Kinesin-related gene unc-104 is required for axonal transport of synaptic vesicles in C. elegans. Cell. 65, 837-847 (1991).
  27. Kumar, J. The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo. PLoS Genet. 6, e1001200 (2010).
  28. Ou, G., Vale, R. D. Molecular signatures of cell migration in C. elegans Q neuroblasts. J. Cell. Biol. 185, 77-85 (2009).
  29. Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction. Nat. Protoc. 2, 1117-1125 (2007).
  30. Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell. Sci. 104, 917-927 (1993).
  31. Louie, K., Russo, G. J., Salkoff, D. B., Wellington, A., Zinsmaier, K. E. Effects of imaging conditions on mitochondrial transport and length in larval motor axons of Drosophila. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 151, 159-172 (2008).
  32. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).

Tags

Biyomühendislik Sayı 67 Moleküler Biyoloji Nörobilim Mikroakiskan, anestezi pre-sinaptik vezikül ulaşım glutamat reseptörlerinin dendritik taşımacılığı mitokondriyal taşımacılık synaptotagmin ulaşım kalp atışı
Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika,… More

Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish. J. Vis. Exp. (67), e3780, doi:10.3791/3780 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter