Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC'er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Summary

En fremgangsmåde til at generere humane inducerede pluripotente stamceller (IPSC'er) via retrovirus-medieret ektopisk ekspression af OCT4 er SOX2, KLF4 og MYC beskrevet. En praktisk måde at identificere menneskelige IPSC kolonier baseret på GFP-ekspression er også diskuteret.

Abstract

Humane embryonale stamceller (hESCs) er pluripotente og en uvurderlig cellulære kilder til in vitro sygdom modellering og regenerativ medicin ^1. Det er tidligere blevet vist, at humane somatiske celler kan omprogrammeres til pluripotens ved ektopisk ekspression af fire transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4 og Myc) og blive induceret pluripotente stamceller (IPSC'er) ^2-4. Ligesom hESCs, er menneskelige IPSC'er pluripotente og en potentiel kilde til autologe celler. Her beskriver vi den protokol, at omprogrammere humane fibroblastceller med de fire omprogrammeringsbeslutninger faktorer klonet i GFP-holdige retroviral rygraden ^4. Brug følgende protokol, vi skaber menneskelige IPSC'er i 3-4 uger under menneskelige ESC kultur tilstand. Humane IPSC kolonier ligner hESCs i morfologi og viser tab af GFP-fluorescens som følge af retroviral transgen lyddæmpning. IPSC kolonier isoleres mekanisk under en fluorescens microscoPE opføre sig på samme måde som hESCs. I disse celler, detektere vi ekspressionen af ​​multiple pluripotens gener og overflademarkører.

Protocol

1. Omprogrammering af Retrovirus udtrykker omprogrammeringsbeslutningerne Faktorer

1. Humane fibroblaster dyrkes på fibroblast-medium (10% FBS i DMEM med Pen / Strep).
2. En dag før infektion, varmeplader 1x10 ⁵ humane fibroblaster i en brønd af en 6-brønds plade.
3. Aspireres mediet at fjerne døde celler, og der tilsættes 2 ml frisk fibroblast medium. Tilsættes protaminsulfat i en endelig koncentration på 5 ug / ml.
4. Forsigtigt tilsættes den passende mængde af hver GFP-udtrykkende virus svarende til en multiplicitet af infektion (MOI). ⁵ 5.
5. En dag efter infektion, fjernes viral supernatant, vaskes tre gange med 2 ml PBS, og derefter tilsættes 2 ml fibroblast medium.
6. Tre dage efter infektion, skal du kontrollere GFP-fluorescens og opfyld godt med 2 ml fibroblast medium.
7. Fire dage efter infektion, ⁴ / cm ² i bestrålede mus embryonisk fibroblast (MEF'er) plade 1x10 fødeceller i fibroblast medium på en10 cm Petri skål coatet med 0,1% gelatine. Inkuber ved 37 ° C natten over.
8. Fem dage efter infektion frigøre inficerede humane fibroblaster med 1 ml 0,05% typsin / EDTA i 5 minutter ved 37 ° C, og centrifugeres i 5 minutter ved 200 g.. Aspirer mediet, og cellerne resuspenderes i 10 ml fibroblast medium. Overføre cellerne til en præ-overtrukket 10-cm plader.
9. Efter 24 timer erstattes mediet med embryonale dyrkningsmedium (20% Knock-out serum udskiftning, DMEM/F12, 0,1 ml ikke-essentielle aminosyrer, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / Glutamat, beta-merceptoethanol). Skift mediet dagligt. ESC-lignende kolonier vil begynde at dukke op ved dag 20-27 efter infektion.

2. Isolering og Udvidelse af IPSC'er

1. Under et fluorescensmikroskop, se for fravær af GFP-fluorescens i en koloni, der viser en lignende morfologi hESCs.
2. Ved hjælp af en 10 gl pipette, vælge individuelle IPSC kolonier og placere dem i en brønd i en gelatine-og MEF-CoATED 12-brønds plade og suppleret med embryonale medium. Ændre medium dagligt.
3. For passage, pladen vaskes med 1 ml DMEM/F12, hvorefter der tilsættes 0,5 ml collagenase, og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
4. Vask cellerne to gange med DMEM/F12.
5. Tilsæt 2 ml frisk embryonale medium. Ved hjælp af en celle løfteren, opbryde kolonier i små stykker og frigøre resterende celler fra pladen.
6. Overfør resuspenderede stykker kolonier i en brønd af en gelatine-og MEF-overtrukne plade med 6 brønde.

3. Immunofluorescensanalyse af Pluripotente markører

1. Vaskes cellerne tre gange med PBS og fastgøres med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur.
2. Forsigtigt vaskes cellerne tre gange med PBS og permeabilisere med 0,2% Triton X-100 i PBS i 30 min.
3. Blokere ikke-specifikke binding ved at inkubere celler med 3% BSA i PBS i to timer.
4. Inkubér cellerne med primært antistof natten over ved 4 ° C.
<li> vaskes cellerne tre gange med PBS og inkuberes cellerne med specifik sekundært antistof i en time ved stuetemperatur, afskærmning mod lys.
5. Vaskes cellerne tre gange med PBS, og der tilsættes DAPI i sidste vask efterfulgt af inkubation ved stuetemperatur i 5 minutter.
6. Detektere farvning med et fluorescensmikroskop.

4. Kvantitativ reel-tid-PCR assay for Pluripotente markører

1. Isolere total RNA fra humane IPSC'er afledt fra humane fibroblaster under anvendelse af Qiagen s RNeasy kittet.
2. Syntetisere den første streng cDNA under anvendelse af SuperScript II revers transkriptase.
3. Udføre qPCR at detektere pluripotens gener ved anvendelse af primere som tidligere rapporteret. ⁶

5. Repræsentative resultater

1. Morfologisk ændring i løbet af omprogrammering
   Vi inficerede humane fibroblaster BJ1 og Detroit 551 med en cocktail af retrovira bærer OCT4, SOX2, KLF4 og myc,og var i stand til at detektere morfologiske ændringer ved omprogrammering (figur 1). Enogtyve dage efter infektion, anerkender vi små IPSC kolonier ved deres embryonale-lignende morfologi. Desuden anerkender vi IPSC'er af GFP-fluorescens. Pluripotente stamceller, såsom ESC og IPSC'er og udtrykker den molekylære maskineri til at undertrykke den provirale genekspression ^7-9. Unikke retroviral vektor udtrykker GFP med omprogrammering gener ved retroviral LTR. Således kan celler kontinuerligt udtrykker GFP anses for at udtrykke transgener uden provirale gendæmpning. Trofast omprogrammerede IPSC kolonier, der erhverver pluripotens molekylære netværk viser fravær af GFP-ekspression (figur 2) ^10.
   
2. Karakterisering af pluripotens af humane IPSC'er
   Vi analyserede kolonier afledt Detroit 551 fibroblaster via immunohistokemi med Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3 OCT4 og NANOG antistoffer ( (figur 3A). Vi analyserede genekspression via kvantitativ RT-PCR-analyse. Vi observerede, at ekspressionen af OCT4 blev SOX2, KLF4, MYC og NANOG signifikant forøget sammenlignet med de parentale fibroblastceller, men svarer til den for H9 hESCs (figur 3B).

Figur 1. Morfologiske ændringer af retrovirus-inficerede humane fibroblaster. (AD) Progressiv morfologisk ændring i kolonier fra Detroit-551 fibroblaster inficeret med omprogrammering faktorer. Dag 5 (A), dag 10 (B), dag 14 (C), dag 21 (D). Celler viser embryonale-lignende morfologi efter 21 dage.

Figur 2. Repræsentant GFP fluorescerende ekspression i celler undergår omprogrammering. 4, og inkuberet i embryonale medium i fire uger. BJ fibroblaster (A, B) og Detroit 551 (C, D) viser lignende morfologisk. Fra dag 21, begynde at GFP negative kolonier til at danne, som repræsenterer de bona fide IPSC'er ^10. (E, F) viser transformerede Detroit 551 celler, der ikke har været underkastet en korrekt reprogrammering. (A, C, E) kolonier under fasekontrast henblik. (B, D) korrekt reprogrammering celler, der viser GFP nedregulering. (F) lys GFP-ekspression fra transformeret koloni.

Figur 3. Karakterisering af de humane inducerede pluripotente stamceller. (A) Humane 551-IPS-K1 cellekolonier udtrykke markører fælles pluripotente celler. DAPI-farvning indikerer den totale celleindholdet per felt. (B) kvantitativ reel tid-PCR (RT-qPCR) til ekspression af OCT4, SOX2, KLF4, MYC i parentale fibroblast og 551-IPS-K1 IPSC'er og H9 humane embryonale stamceller (hESCs). Data blev normaliseret mod β-actin rengøring genet og afbildet i forhold til ekspressionsniveauet for de parentale fibroblastceller ^4.

Discussion

Ekspression af fire transkriptionsfaktorer omprogrammerer humane fibroblaster til IPSC'er. Mange forsøg på at generere humane IPSC'er med ikke-integrerende eller ikke-genetiske fremgangsmåder til at generere klinisk sikre IPSC'er. Hidtil har disse metoder udviser ekstremt lave effektivitet og kræver yderligere optimering for at forbedre reproducerbarheden ^11-14. Retro-eller lentiviral metoder let bruges til at udlede og anvende IPSC'er til human in vitro sygdomsmodeller, som er mindre afhængige af de sikkerhedsproblemer som følge af viral integration. Omprogrammering her beskrevne fremgangsmåde er til rådighed for en effektiv afledning af humane IPSC'er. Valg af menneskelige IPSC'er er primært baseret på kolonimorfologi, der ligner menneskelige økonomiske og sociale råd. Vigtigere vores fremgangsmåde drager fordel af funktionen af inaktivering af de retrovirale lange terminale repeats (LTR) i pluripotente stamceller ^7,15. Den retrovirale vektor, der anvendes i denne protokol indeholder GFP-genet forbundet til omprogrammeringfaktorer via en internt ribosomt indgangssted Sequence (IRES) og ^5. GFP-ekspression drives af provirale LTR. Fibroblasterne inficeret med disse vira oprindeligt viser lyse GFP-ekspression. Når fuldt omprogrammeres, vil IPSC'er miste GFP-ekspression, som er let visualiseres under et fluorescensmikroskop. I denne protokol, beskrev vi den generation af IPSC'er fra føtale og neonatale fibroblaster (Detroit 551 og BJ1). Imidlertid er denne retrovirale vektor er blevet anvendt til at generere IPSC'er fra normale voksne fibroblaster samt en række patienter med mendelske og komplekse sygdomme ^4,16,17.

Tidligere har vi analyseret ændringen i cellulære overflademarkører under humane somatiske celler omprogrammering ^10. Der er en progressiv ændring i celleoverflademarkører. Fibroblaster udtrykker CD13, som undertrykkes af ekspressionen af ​​omprogrammering. Celler under omprogrammering start udtrykke SSEA4 sammen med GFP. Derefter, mister de expressiom af GFP via provirale silecing og udtrykker yderligere pluripotency maker TRA1-60 ^10. Ekspressionen af ​​TRA1-60 er godt korreleret med GFP lyddæmpning og veludviklet teratom formation, hvilket antyder, at TRA1-60 er en markør for nøjagtigt omprogrammerede IPSC'er. GFP tavshed er den alternative markør for TRA1-60 udtryk og giver mulighed for identifikation af IPSC kolonier uden besværlige levende cellefarvning. Med tabet af GFP-ekspression som en markør for IPSC'er, stamcelle-forskere, som ikke har nogen forudgående erfaring med omprogrammering vil hurtigt og konsekvent isolere IPSC'er.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80%
Knockout Serum Replacer	Invitrogen	10828-028	20%
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Nonessential Amino Acids (10 mM)	Invitrogen	11140050	0.1 mM
β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG	Invitrogen	M-6250	0.1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, by Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
DMEM	Invitrogen	11965118	90%
FBS	Invitrogen	10407028	10%
Penicillin/Streptomycin	EMD Millipore	15140-122	1%
Table 1. Culture Medium
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Flur 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Flur 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagenase type IV	Invitrogen	17104019	1mg/ml
Gelatin, Porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0.1%
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0.2%
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	47608	4%
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3%
MEF feeder cells	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter
Table 2. Reagents and equipment