Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Résumé

Une méthode pour générer de l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) via un rétrovirus médiation expression ectopique de OCT4, SOX2, KLF4 et MYC est décrite. Un moyen pratique pour identifier l'homme colonies iPSC fondées sur l'expression de GFP est également discuté.

Résumé

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont pluripotentes et une source précieuse pour cellulaires dans la modélisation des maladies in vitro et la médecine régénérative ^1. Il a été montré précédemment que des cellules somatiques humaines peuvent être reprogrammées pour la pluripotence par l'expression ectopique de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et Myc) et devenir cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^2-4. Comme les CSEh, CSPi humaines sont pluripotentes et une source potentielle de cellules autologues. Nous décrivons ici le protocole de reprogrammer des cellules de fibroblastes humains avec les quatre facteurs de reprogrammation clonés dans GFP-rétroviral contenant un squelette ^4. En utilisant le protocole suivant, nous générons CSPi de l'homme dans les 3-4 semaines dans des conditions de culture des CSE humaines. Homme colonies iPSC ressemblent CSEh dans la morphologie et afficher la perte de la GFP de fluorescence en résultat de l'inactivation transgène rétroviral. colonies isolées iPSC mécaniquement sous un microsco fluorescencepe se comporter de la même façon que les CSEh. Dans ces cellules, nous avons détecter l'expression de multiples gènes de pluripotence et des marqueurs de surface.

Protocole

1. Reprogrammation par rétrovirus exprimant les facteurs de reprogrammation

1. Des fibroblastes humains sont cultivées dans un milieu des fibroblastes (10% de FBS dans DMEM avec Pen / Strep).
2. Un jour avant l'infection, la plaque de 1x10 ⁵ fibroblastes humains dans un puits d'une plaque à 6 puits.
3. Aspirer à moyen et à éliminer les cellules mortes et ajoutez 2 ml de milieu de fibroblastes frais. Ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 5 ng / ml.
4. Soigneusement ajouter la quantité appropriée de chacun des virus GFP-exprimer correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) ⁵ 5.....

Discussion

L'expression de facteurs de transcription quatre fibroblastes humains à la reprogrammation des CSPi. De nombreuses tentatives ont été faites pour produire des CSPi humaines en utilisant des approches non-intégration ou non-génétiques pour générer CSPi cliniquement sûres. Jusqu'à présent, ces méthodes montrent l'efficacité très faible et nécessitent une optimisation plus poussée pour améliorer la reproductibilité ^11-14. Rétro-méthodes ou lentiviral sont facilement utilisée pour calculer et applique.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12	Invitrogen	11330057	80 %
Substitut de sérum Knockout	Invitrogen	10828-028	20 %
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen	25030081	2 mM
Acides aminés non essentiels (10 mM)	Invitrogen	11140050	0,1 mM
β-Mercapt–éthanol (14,3 M) ou MTG	Invitrogen	M-6250	0,1 mM
bFGF-2 10 μg/ml	GIBCO, par Life Technologies	GF003AF	4 ng/ml
Pénicilline/Streptomycine	EMD Millipore	15140-122	1 %
DMEM	Invitrogen	11965118	90 %
FBS	Invitrogen	10407028	10 %
Pénicilline/Streptomycine	EMD Millipore	15140-122	1 %
Tableau 1. Milieu de culture
OCT4	Abcam	Ab19857	1:500
SSEA3	EMD Millipore	MAB4303	1:100
SSEA4	BD Biosciences	BD560218	1:100
Tra-1-81	BD Biosciences	BD560173	1:100
Tra-1-60	BD Biosciences	BD560174	1:100
NANOG	Abcam	Ab21624	1:500
Alexa-Fluor 488	Invitrogen	A11008	1:1000
Alexa-Fluor 555	Invitrogen	A21422	1:1000
DAPI	Invitrogen	D1306	1:5000
pMIG-OCT4	Addgene	17225
pMIG-SOX2	Addgene	17226
pMIG-KLF4	Addgene	17227
pMIG-MYC	Addgene	18119
Collagénase de type IV	Invitrogen	17104019	1 mg/ml
Gélatine, porcine	Sigma-Aldrich	G 1890	0,1 %
Triton	Sigma-Aldrich	X100-500ML	0,2 %
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	47608	4 %
BSA	American Bioanalytical	AB01800	3 %
Cellules nourricières MEF	EMD Millipore	PMEF-N
Cell Lifter	Corning	3008
Microscopie en fluorescence : microscope inversé avec filtre GFP
Tableau 2. Réactifs et équipements