Summary
OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포는 (hESCs) pluripotent 및 체외 질병 모델링과 의학 1 재생에 대한 소중한 휴대 소스입니다. 그것은 이전에 인간의 체세포은 4 전사 요인 자궁외 표현 (Oct4, Sox2, Klf4과 Myc)에 의해 pluripotency로 다시 프로그램 및 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs에게) 2-4이 될 수있는 것으로 나타났습니다. hESCs 마찬가지로, 인간 iPSCs는 pluripotent과 autologous 세포에 대한 잠재적인 소스입니다. 여기 GFP 함유 retroviral 등뼈 네에 복제된 네 개의 프로그래밍 요소와 인간 fibroblast 세포를 재설 정할 프로토콜을 설명합니다. 다음과 같은 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간 ESC의 배양 조건 하에서 3~4주 인간 iPSCs를 생성합니다. 인간 iPSC의 식민지가 밀접한 형태의 hESCs 닮은 및 retroviral transgene의 입을의 결과로 GFP 형광의 손실을 표시합니다. iPSC의 식민지는 형광 microsco하에 기계적으로 분리PE는 hESCs과 비슷한 방식으로 동작합니다. 이러한 세포에서는 여러 pluripotency 유전자 및 표면 마커의 표현을 감지.
Protocol
1. 프로그래밍 요소를 표현 레트로 바이러스에 의해 프로그래밍
- 인간 섬유아 세포는 fibroblast 매체 (10 % 펜 / Strep과 DMEM에 FBS)에서 배양해 있습니다.
- 6 - 잘 접시들이 한에 감염 전에 언젠가, 플레이트 1x10 5 인간 섬유아 세포.
- 죽은 세포를 제거하고 신선한 fibroblast 매체 2 ML을 추가하는 매체를 기음. 5 μg / ML의 최종 농도에서 프로타민 황산염을 추가합니다.
- 조심스럽게 감염의 다수 (방어) 5 5에 해당하는 각 GFP-표현 바이러스의 적절한 금액을 추가합니다.
- 두 ML의 fibroblast 매체를 추가 후, 어느 날 감염 후, 바이러스 표면에 뜨는을 제거 2 ML PBS로 세 번 씻는다.
- 사흘 감염 후, GFP의 형광을 확인하고 두 ML의 fibroblast 매체와 우물을 보충.
- 향해 fibroblast 매체에서 4 일 감염 후 접시 1x10은 조사 마우스 배아 fibroblast 4 / ㎝ 2 (MEFs) 피더 세포10 cm 배양 접시는 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C 하룻밤 사이에 알을 품다.
- 닷새 감염 후, 1 ML 0.05 % typsin / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 15 분 37 ° C 및 200g에서 5 분간 원심 분리기에 감염된 인간의 섬유아 세포를 분리. 매체를 기음과 fibroblast 매체 10ml로 세포를 resuspend. 미리 코팅된 10-cm 판으로 세포를 전송합니다.
- 24 시간 이내에, hESC 배양 매체 (20 % 노크 아웃 혈청 교체, DMEM/F12, 0.1 ML 비 필수 아미노산, 4 NG / ML bFGF, 펜 / Strep / 글루 탐 산염, 베타 merceptoethanol)로 매체를 교체하십시오. 매일 매체를 변경합니다. ESC와 같은 식민지 감염 후 20-27 일에 의해 나타나기 시작합니다.
2. iPSCs의 분리 및 확장
- 형광 현미경에서 hESCs에 유사한 형태를 보여줍니다 식민지에서 GFP 형광의 부재를 확인한다.
- 10 μl 피펫을 사용하여 개별 iPSC 식민지를 선택하고 젤라틴 및 MEF-COA 잘 하나에 넣어테드 12 잘 플레이트와 hESC 매체와 보충. 매일 매체를 변경합니다.
- passaging 들어, DMEM/F12 1 ML과 접시를 씻으 다음, collagenase 0.5 ML을 추가, 37시 10 분 품어 ° C를
- DMEM/F12으로 두 세포를 씻으십시오.
- 신선한 hESC 매체 2 ML을 추가합니다. 셀 리프터를 사용하여 작은 조각으로 식민지를 헤어지게하고 접시에서 남아있는 세포를 분리.
- 젤라틴 및 MEF-코팅 6 - 잘 접시의 잘 하나에 콜로니 resuspended 조각을 전송합니다.
3. Pluripotent 마커 Immunofluorescence 분석
- PBS로 세포가 세 번 씻어하고 실온에서 20 분에 대한 4 % paraformaldehyde로 고정시킨다.
- 부드럽게으로 0.2 % Triton은 30 분 대한 PBS의 X-100. PBS로 세포가 세 번 씻고 permeabilize
- 두 시간 동안 PBS에서 3 % BSA와 세포를 잠복기가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다.
- 4에서 하룻밤 일차 항체와 세포를 품어 ° C. <리> PBS로 세포가 세 번 씻고 빛으로부터 차폐, 실온에서 한 시간 만이라도 특정한 이차 항체와 세포를 품어.
- 5 분간 실온에서 배양 다음 마지막으로 세척하는 동안 PBS와 추가 DAPI로 세포 세 번 씻는다.
- 형광 현미경으로 염색법을 검색.
4. Pluripotent 마커에 대한 정량 실시간 PCR 분석
- Qiagen의 RNeasy 키트를 사용하여 인간의 섬유아 세포에서 파생된 인간 iPSCs에서 총 RNA를 분리.
- 윗첨자 II 역방향 Transcriptase를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성.
- 이전에 보고된 primers를 사용하여 pluripotency 유전자를 검색할 qPCR을 수행 6.
5. 대표 결과
- 프로그래밍 중에 형태학의 변화
우리는 OCT4, SOX2, KLF4 및 MYC 들고 retroviruses의 칵테일과 함께 인간의 섬유아 세포에게 BJ1와 디트로이트 551 감염,하고 (그림 1) 프로그래밍을하는 동안 형태학의 변화를 감지할 수 있었다. 스물 일일 감염 후, 우리는 그들의 hESC 같은 형태로 작은 iPSC 식민지 인식하고 있습니다. 더욱이, 우리는 GFP의 형광에 의해 iPSCs을 인식하고 있습니다. 이러한 ESCs 및 iPSCs 같은 Pluripotent 줄기 세포는 proviral 유전자 발현에게 7-9을 주체할하는 분자 기계를 표현. 우리 고유의 retroviral 벡터는 retroviral LTR에 의해 유전자 프로그래밍을 함께 GFP를 표현합니다. 따라서 지속적으로 GFP를 표현하는 세포 proviral 유전자 입을없이 transgenes을 표현하는 것으로 간주됩니다. pluripotency 분자 네트워크를 취득 충실하게 다시 프로그램 iPSC 식민지는 GFP 표현식 (그림 2) 10의 부재를 보여줍니다. - 인간 iPSCs의 pluripotency의 특성화
우리는 Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 및 NANOG의 항체 (과 immunohistochemistry를 통해 디트로이트-551 섬유아 세포에서 파생된 식민지를 분석
1 그림. 레트로 바이러스에 감염된 인간 섬유아 세포의 형태학의 변경됩니다. (AD) 프로그래밍 요소에 감염된 디트로이트 - 551 섬유아 세포에서 식민지의 프로 그레시브 형태학의 변화. 5 일 (A), 10 일째 (B) 일 14 (C) 일 21 (D). 셀은 21 일 후에 hESC 같은 형태를 보여줍니다.
그림 2. 언어학 재활 치료를 받고 셀에 대표 GFP 형광 표현. 4 표현에 감염, 그리고 4 주 동안 hESC 매체에 incubated했다. BJ 섬유아 세포 (A, B)와 디트로이트 551 (C, D)는 형태학의 유사한 표시됩니다. 일 21 일부터, GFP 부정적인 식민지는 타고난 iPSCs 10을 대표하는 형성되기 시작합니다. (E, F)의 적절한 언어학 재활 치료를받은하지 않은 디트로이트 551 세포를 변형 보여줍니다. 위상 콘트라스트보기 미만 (A, C, E) 식민지. (B, D) 제대로 GFP의 입을 보여주 세포를 다시 프로그램. 변환 콜로니 (F) 밝은 GFP 발현.
그림 3. 인간 유도된 pluripotent 줄기 세포의 특성화. () 휴먼 551-IPS-K1 세포 식민지는 pluripotent 세포에 공통 마커를 표현. DAPI의 염색법, 분야마다 전체 셀 내용을 나타냅니다. 부모 F의 (B)를 정량 실제 OCT4 표현을위한 시간을 PCR (RT-qPCR), SOX2, KLF4, MYCibroblast, 551-IPS-K1의 iPSCs하고, H9 인간 배아 줄기 세포 (hESCs). 데이터는 β-actin의 가사 유전자에 대한 정규화와 부모 fibroblast 세포 4의 표현 수준에 상대적으로 꾸몄다되었다.
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Discussion
iPSCs 내지 네 전사 요인 reprograms 인간 섬유아 세포의 표현. 많은 시도가 임상적으로 안전 iPSCs을 생성하는 비 통합 또는 비 유전자 접근 방법을 사용하여 인간 iPSCs를 생성하는 데 있었다. 지금까지 이러한 방법은 매우 낮은 효율을 보여 주며 재현성 11-14 향상을 위해 더욱 최적화가 필요합니다. 레트로 또는 lentiviral 방식은 쉽게 도출 및 바이러스성 통합으로 인한 안전 문제에 덜 의존 체외 질환 모델에서 인간에 대한 iPSCs를 적용하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 방법을 프로그래밍하는 것은 인간 iPSCs의 효율적인 유도에 사용할 수 있습니다. 인간 iPSCs의 선정은 주로 인간 ESCs 유사한 식민지의 형태에 따라 달라집니다. 더 중요한 건, 우리의 방법은 pluripotent 줄기 세포 7,15에 retroviral 긴 터미널 반복 (LTR)의 입을의 기능을 활용합니다. 이 프로토콜에서 사용 retroviral 벡터는 언어학에 링크된 GFP 유전자를 포함내부 Ribosome 덜컹 (IRES)와 5를 통해 요인. GFP 발현은 proviral LTR에 의해 구동됩니다. 이 바이러스에 감염된 섬유아 세포는 처음에는 밝은 GFP 식을 보여줍니다. 일단 완전히 다시 프로그램, iPSCs는 형광 현미경으로 쉽게 시각이다 GFP 발현을 잃게됩니다. 이 프로토콜에서는 태아 및 신생아 섬유아 세포 (디트로이트 551과 BJ1)에서 iPSCs의 생성을 설명했다. 그러나이 retroviral 벡터 정상 성인 섬유아 세포에서 iPSCs뿐만 아니라 Mendelian 복잡한 장애 4,16,17 환자의 다양한 생성하는 데 사용되었습니다.
이전에 우리는 10 프로그래밍을 인간 체세포 동안 세포 표면 마커의 변화를 분석했습니다. 세포 표면 마커의 진보적인 변화가있다. 프로그래밍의 표현에 의해 억압되어 섬유아 세포 급행 CD13. 세포가 GFP와 SSEA4 함께 표현하는 프로그래밍을 시작을 진행. 그런 다음, 그들은 expressi를 잃게proviral silecing 표현 추가 pluripotency 메이커 TRA1-60 10를 통해 GFP의에. TRA1-60의 표현이 잘 TRA1-60 신실하게 다시 프로그램 iPSCs위한 마커는 것을 제안, GFP의 입을와 잘 발달된 teratoma 형성과 상호있다. GFP 입을은 TRA1-60 표현을위한 대체 마커이며 힘드는 라이브 세포 염색법없이 iPSC 콜로니의 식별이 가능합니다. iPSCs위한 마커로서 GFP의 표현의 손실을 이용하여 쉽게하고 일관되게 iPSCs를 분리합니다 프로그래밍에는 사전 경험이없는 세포 과학자의 줄기.
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Acknowledgments
이 작품은 찰스 후드 재단의 의학 및 아동 보건 연구 상을 예일 학원에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330057 | 80% |
| Knockout Serum Replacer | Invitrogen | 10828-028 | 20% |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | 2 mM |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | Invitrogen | 11140050 | 0.1 mM |
| β-Mercapt–thanol (14.3 M) or MTG | Invitrogen | M-6250 | 0.1 mM |
| bFGF-2 10 μg/ml | GIBCO, by Life Technologies | GF003AF | 4 ng/ml |
| Penicillin/Streptomycin | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | 90% |
| FBS | Invitrogen | 10407028 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| Table 1. Culture Medium | |||
| OCT4 | Abcam | Ab19857 | 1:500 |
| SSEA3 | EMD Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| SSEA4 | BD Biosciences | BD560218 | 1:100 |
| Tra-1-81 | BD Biosciences | BD560173 | 1:100 |
| Tra-1-60 | BD Biosciences | BD560174 | 1:100 |
| NANOG | Abcam | Ab21624 | 1:500 |
| Alexa-Flur 488 | Invitrogen | A11008 | 1:1000 |
| Alexa-Flur 555 | Invitrogen | A21422 | 1:1000 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000 |
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Collagenase type IV | Invitrogen | 17104019 | 1mg/ml |
| Gelatin, Porcine | Sigma-Aldrich | G 1890 | 0.1% |
| Triton | Sigma-Aldrich | X100-500ML | 0.2% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 47608 | 4% |
| BSA | American Bioanalytical | AB01800 | 3% |
| MEF feeder cells | EMD Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
| Table 2. Reagents and equipment | |||
References
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