Summary
Demonstratie van een snelle kwantitatieve analyse van de remming van bloedstolling door de laag moleculair gewicht heparine, enoxaparine. De bijdrage van enoxaparine wordt beoordeeld door het verwijderen van de invloed door digestie met heparinase. Een vollediger beschrijving van de assay wordt beschreven in onze gepubliceerde papier.
Abstract
Er is behoefte aan een klinische test om de mate waarin een patiënt bloed effectief wordt geanticoaguleerd de laag moleculair gewicht heparine (LMWH), enoxaparine bepalen. Er zijn ook dringend klinische situaties waarin het belangrijk als deze snel kunnen worden bepaald. Deze test is ontworpen om dit te bereiken. We alleen getest menselijke bloedmonsters die werden gespiked met bekende concentraties enoxaparine. Het essentiële kenmerk van de onderhavige assay is het kwantificeren van de werkzaamheid van enoxaparine in bloed van een patiënt monster degraderen inactiviteit compleet met heparinase. Twee bloedmonsters werden bij Vacutainer buizen (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ) die zijn verrijkt met enoxaparine; een monster werd geknipt met heparinase gedurende 5 min bij 37 ° C en het andere monster van de patiënt weergegeven basislijn anticoagulanteerd status. Het percentage kortere stollingstijd in de heparinase-behandelde monster, in vergelijking met de baseline staat, leverde de anticoagulerende bijdrage van enoxaparine. We gebruikten de draagbare batterijen Hemochron 801 Inrichting voor het meten van stollingstijden (International Corp Technidyne, Edison, NJ). De inrichting heeft 2 thermostaat (37 ° C) assay waterputten. We de assays uitgevoerd in twee soorten assay cartridges die bij de fabrikant van het instrument. Een cartridge werd gemodificeerd om de gevoeligheid te verhogen. We verwijderden het kaolien de FTK-ACT cartridge door uitgebreid spoelen met gedestilleerd water, waardoor alleen het glas van de buis, en misschien de detectie magneet als activatoren. We noemden dit ons minimaal geactiveerd assay (MAA). Het gebruik van een minimaal geactiveerde assay is bestudeerd door ons en anderen. 2-4 De tweede patroon dat werd onderzocht was geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT) assay (A104). Dit werd gebruikt als geleverd door de fabrikant. De thermostaat putten van het instrument were zowel voor de heparinase spijsvertering en stollingstesten. De test kan worden uitgevoerd binnen 10 minuten. De MAA test ingrijpende wijzigingen in de stollingstijd toonde na heparinase vertering van enoxaparine over een typisch klinisch concentratiebereik. Bij 0,2 anti-Xa IE enoxaparine per ml bloed monster, heparinase spijsvertering veroorzaakt een daling van gemiddeld 9,8% (20,4 sec) in stollingstijd; bij 1,0 IE per ml enoxaparine was er een daling van 41,4% (148,8 sec). Dit rapport presenteert alleen de experimentele toepassing van de test; zijn waarde in een klinische setting moet nog worden vastgesteld.
Protocol
1. Heparinase Reconstitutie
- Gevriesdroogd heparinase I is commercieel verkregen (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) in flesjes van 1 mg van het gezuiverde eiwit. Het eiwit wordt opgelost in 0,25 ml zoutoplossing (0,9% NaCl).
2. Verzameling van bloedmonsters
- Twee bloedmonsters getrokken door vacuum in natriumcitraat (0,3 ml 0.109M; 3,2%) gebufferde Vacutainer buizen (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); de buizen zowel pre-behandeld met een bekende concentratie van enoxaparine; het bloedvolume dat getekend is 2,7 ml. Het totale gehalte is dan 3,0 ml.
3. Heparinase Spijsvertering
- De volledige inhoud van de heparinase injectieflacon kan worden opgezogen in een injectiespuit (ongeveer 0,2 ml, 80% van de flacon, 0,8 ug eiwit), wordt overgedragen op een Vacutainer buis 0,2 ml zoutoplossing (0,9% NaCl) toegevoegd de tweede buis, die als baseline staat voor eliminatie van de enoxaparine effect.
- Beide Vacutainer buizen worden in de putjes van de thermostaat Hemochron inrichting gedurende 5 min. (De geschiktheid van een 5 min spijsvertering tijd met heparinase werd opgericht in onze eerder gepubliceerde werk. 1)
4. Stolling Assays
- Aan het einde van de heparinase incubatie wordt 2,0 ml bloed naar de assay cartridge. In het geval van de MAA buis is voorgevuld met 0,1 ml 250 mM CaCl2 om coagulatie te leiden. De commerciële aPTT assay cartridge (A104) is ontworpen om stolling te leiden in bloed dat is getrokken in Vacutainer buizen die natriumcitraat als anticoagulant.
- De Hemochron apparaat signaleert de voltooiing van de bloedstolling en behoudt de stollingstijd in seconden. Het verschil in stollingstijden tussen heparinase behandelde monster als het basislijnmonster, gedeeld door de stolling time voor de basislijn monster, levert het percentage daling als gevolg van de eliminatie van enoxaparine. Zoals hieronder besproken, hebben sterke lineaire correlatie verkregen voor de relatie tussen percentage afname in stollingstijd en de concentratie van enoxaparine in verrijkte monsters van bloed, en de correlatie met enoxaparine gemeten concentraties van de chromgenic bepaling van anti-Xa activiteit. Anti-Xa assays van enoxaparine concentratie werden uitgevoerd met een commerciële kit voor een tweetraps chromogene assay (BIOPHEN, Aniara, Mason, OH).
Representative Results
Figuur 1 toont de resultaten voor het verband tussen het percentage afname in klontertijd na verwijdering van enoxaparine met heparinase voor een reeks spiked concentraties enoxaparine (0,2, 0,4 en 1,0 anti-Xa IE per ml). Resultaten worden gepresenteerd voor zowel de MAA en aPTT assay cartridges. De gemeten concentraties enoxaparine van chromogene assay van anti-Xa-activiteit zijn ook opgenomen in de abscis van elk perceel.
Figuur 2 toont grafieken van dezelfde gegevens als percentage afname in klontertijd vs chromogene mate van anti-Xa activiteit.
Sterke lineaire correlatie met hoge statistische significantie werd voor alle vier relaties.
Figuur 1. Point-of care bepalingen van enoxaparine contribution om stolling tijden van spiked volbloed gebaseerd op het percentage verandering (verkorting) van de stollingstijd na incubatie met heparinase. De spiked enoxaparine concentraties toegevoegd aan bloed en de gemeten anti-Xa plasmaconcentraties (gemiddelde ± SE, tussen haakjes) worden in de abscis van elke grafiek. Alle procentuele veranderingen in stollingstijden worden gepresenteerd als gemiddelden en SE, en het gemiddelde verkorting van de stollingstijd in seconden. Gegevens van dezelfde patiënt zijn verbonden door stippellijnen. De gegevens voor de vier patiënten geïdentificeerd met sterretjes in plot A (MAA resultaten) zijn dezelfde als in de vier patiënten B plot (aPTT assays). Alle resultaten vormen afzonderlijke analyses. De Pearson correlatiecoëfficiënten waren r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) en r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) voor de relaties met de MAA en aPTTassay, respectievelijk. Overgenomen met toestemming van Inchiosa et al. 1.
. Figuur 2 De resultaten voor de procentuele verandering in stollingstijden in de point-of-care assays getoond in figuren 1A en B als functie van de plasma anti-factor Xa concentraties A, MAA resultaten;. B, aPTT assays. Alle resultaten zijn uit een stollingstijd assays en enkelvoudige metingen van anti-factor Xa concentraties. De Pearson correlatiecoëfficiënten waren r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) en r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) voor de relaties met de MAA en aPTT-test, respectievelijk overgenomen met toestemming van Inchiosa et al. 1.
Discussion
Deze test van enoxaparine werkzaamheid kan dienen als een belangrijke optie voor de relatieve veiligheid van het uitvoeren van een invasieve procedure die een verzorger risico op bloedingen of de ontwikkeling van een hematoom is vast te stellen. Dit zou met name belangrijk wanneer een epidurale injectie wordt overwogen. De meerderheid van de richtlijnen bevelen een wachttijd van 12 uur tussen injectie van enoxaparine en inleiding van een invasieve procedure 5 Nierinsufficiëntie, obesitas en zwangerschap kunnen de dosering eisen van enoxaparine beïnvloeden 6,7 Omdat de test kan worden voltooid binnen een 10.. - min periode, kan het ook gebruikt worden in een kliniek of arts het kantoor, waar het zou informatie over de geschiktheid van antistolling bij patiënten die op een risico van ontwikkeling van veneuze trombo-embolie te bieden. Onmiddellijke aanpassing van de dosering kan worden ingesteld, als dat nodig is.
De enoxaparine concentratie in plasma kan worden gemeten door een chromogene eenssay van de mate van remming van de stollingsfactor Xa. Echter, dit alleen geeft de concentratie, die niet specifiek zijn anticoagulans werkzaamheid, die op grote schaal varieert tussen de individuele patiënten. 6 tot 8
Onze studies werden uitgevoerd alleen met enoxaparine. Het kan echter worden verwacht dat de assay kan worden toegepast op elk LMWH dat wordt afgebroken door heparinase I. Deze reeds bekend is het geval voor dalteparine, nadroparine en tinzaparin zijn. 9-11 We hebben de test met betrekking tot de kenmerken van de Hemochron stollingstijd instrument. Het instrument is relatief goedkoop, ook, de wegwerp bloedafnamebuisjes, heparinase ampul, en test patronen te voltooien een analyse voor een patiënt is ongeveer 15 dollar. Zo zou men kunnen verwachten dat geschikt om anticoagulant status controleren in verschillende klinische instellingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De onderzoeken werden uitgevoerd uitsluitend met steun van afdelings-en institutionele middelen. De coagulatie apparatuur (Hemochron 801) werd geleend zonder de verplichting van de fabrikant. De test cartridges werden gekocht bij hun retail kosten. De inleidende figuur in de video werd gewijzigd van Sanderink, et al.. 12 De tweede figuur in de video (heparinase spijsvertering tijdsverloop) werd overgenomen met toestemming van Inchiosa et al. 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
