Summary
Demonstração de um ensaio rápido quantitativa da inibição da coagulação do sangue pelo baixo peso molecular, heparina, enoxaparina. A contribuição de enoxaparina é avaliada através da remoção de sua influência através da digestão com heparinase. Uma descrição mais completa do ensaio está detalhado em nosso trabalho publicado.
Abstract
Existe a necessidade de um ensaio clínico para determinar a extensão em que o sangue de um paciente é eficazmente anticoagulados pelo baixo peso molecular, heparina (HBPM), enoxaparina. Existem também situações clínicas urgentes onde seria importante se este pudesse ser determinado rapidamente. O presente ensaio é projetado para fazer isso. Nós só ensaiadas amostras de sangue humano que foram fortificadas com concentrações conhecidas de enoxaparina. A característica essencial do presente ensaio é o de quantificar a eficácia da enoxaparina na amostra de sangue de um paciente por degradando-a à inactividade completa com heparinase. Duas amostras de sangue foram colhidas em tubos Vacutainer (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ), que foram adicionadas com a enoxaparina, uma amostra foi digerido com heparinase durante 5 min a 37 ° C, a amostra de outro estado representado basais do doente anticoagulado. O encurtamento do tempo de coagulação por cento na amostra tratada com heparinase, em comparação com o bEstado aseline, rendeu a contribuição de anticoagulante enoxaparina. Utilizou-se o portátil, bateria operado Hemochron aparelho 801 para a medição de tempos de coagulação (International Technidyne Corp, Edison, NJ). O aparelho tem duas controlados por termostato (37 ° C) poços para tubos de ensaio. Conduzimos ensaios em dois tipos de cartuchos de ensaio que estão disponíveis a partir do fabricante do instrumento. Um cartucho foi modificado para aumentar a sua sensibilidade. Removemos o caulino a partir do cartucho FTK-ACT por extensa lavagem com água destilada, deixando apenas a superfície do tubo de vidro, e, talvez, o íman de detecção, como activadores. Nós chamamos este ensaio nosso minimamente ativado (MAA). O uso de um ensaio minimamente activada tem sido estudada por nós e outros. 2-4 O segundo cartucho que foi estudado era um tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) (A104). Este foi utilizado como fornecido pelo fabricante. Os poços regulados por termóstato do instrumento were utilizado tanto para a heparinase digestão e ensaios de coagulação. O ensaio pode ser concluída dentro de 10 min. O ensaio mostrou mudanças MAA robustos em tempo de coagulação, após digestão com heparinase da enoxaparina sobre uma gama de concentrações clínico típico. A 0,2 UI anti-Xa de enoxaparina por ml de amostra de sangue, a digestão heparinase causou uma diminuição média de 9,8% (20,4 s) no tempo de coagulação, com 1,0 UI por ml de enoxaparina houve uma redução de 41,4% (148,8 seg.) Este relatório apresenta apenas a aplicação experimental do ensaio, e seu valor em um ambiente clínico deve ainda ser estabelecida.
Protocol
1. Reconstituição heparinase
- Heparinase I liofilizado é obtido comercialmente (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10), em frascos contendo 1 ug de proteína purificada. A proteína é dissolvida em 0,25 ml de solução salina (NaCl 0,9%).
2. Coleta de amostras de sangue
- Duas amostras de sangue são retirados por vácuo em citrato de sódio (0,3 ml 0.109M; 3,2%) tamponada tubos Vacutainer (Becton-Dickinson; Franklin Lakes, NJ), e os tubos são ambos pré-cravado com uma concentração conhecida de enoxaparina, o volume de sangue que é extraído é de 2,7 ml. O teor total é então 3,0 ml.
3. Digestão heparinase
- A totalidade do conteúdo do frasco de heparinase que pode ser aspirado para uma seringa (cerca de 0,2 ml, 80% do frasco e 0,8 ^ g de proteína), é transferida para um tubo Vacutainer; 0,2 ml de solução salina (NaCl 0,9%) é adicionado a o segundo tubo, que serve como o baseline estado antes da eliminação do efeito de enoxaparina.
- Ambos os tubos Vacutainer são colocados nos poços de controlo termostático do aparelho Hemochron por um período de 5 min. (A adequação de um tempo de digestão 5 min com heparinase foi criada em nosso trabalho publicado anteriormente. 1)
4. Ensaios de coagulação
- No final da incubação, heparinase, 2,0 ml de sangue é transferido para o cartucho de teste. No caso de o tubo de MAA, é pré-cheia com 0,1 ml de 250 mM CaCl 2 para iniciar a coagulação. O comercial aPTT ensaio cartucho (A104) é projetado para iniciar a coagulação no sangue, que foi elaborado em tubos Vacutainer contendo citrato de sódio como anticoagulante.
- O aparelho Hemochron sinaliza a conclusão da coagulação do sangue e preserva os tempos de coagulação em segundos. A diferença nos tempos de coagulação entre a amostra tratada com heparinase e da amostra de referência, dividida pela ti coagulaçãome para a amostra de linha de base, produz a redução percentual resultante da eliminação da enoxaparina. Como discutido abaixo, fortes correlações lineares foram obtidos para a relação entre a redução percentual do tempo de coagulação e a concentração de enoxaparina em amostras enriquecidas de sangue total, bem como para a correlação com concentrações moderadas de enoxaparina pelo ensaio chromgenic de anti-Xa atividade. Anti-Xa ensaios de concentração de enoxaparina foram realizadas com um kit comercial para um ensaio cromogénico de dois estágios (BIOPHEN; Aniara, Mason, OH).
Representative Results
A Figura 1 apresenta os resultados para as relações entre a redução percentual no tempo de coagulação após a eliminação da enoxaparina com heparinase para uma série de concentrações de perfurantes enoxaparina (0,2, 0,4 e 1,0 anti-Xa UI por ml). Os resultados são apresentados para ambos o MAA e cartuchos de teste de APTT. As concentrações medidas de enoxaparina de ensaio cromogénico de actividade anti-Xa está também incluída na abcissa de cada trama.
A Figura 2 apresenta gráficos de os mesmos dados como redução percentual no tempo de coagulação vs cromogénico medida de actividade anti-Xa.
Fortes correlações lineares, com elevada significância estatística, foram encontrados para todas as quatro relações.
Figura 1. Ponto de determinações de cuidados de enoxaparina contribution para os tempos de coagulação de sangue total cravado com base em alteração percentual (encurtamento) do tempo de coagulação, após incubação com heparinase. As concentrações de enoxaparina perfurantes adicionado ao sangue total e as concentrações medidos anti-Xa no plasma (média ± SE, entre parênteses) são colocados na abcissa de cada gráfico. Todas as variações percentuais em tempos de coagulação são apresentados como médias e SE, em conjunto com o encurtamento do tempo médio de coagulação em segundos. Os dados do paciente mesmo estão ligados por linhas tracejadas. Os dados para as quatro pacientes identificados com asteriscos na trama A são (resultados MAA) o mesmo que os quatro pacientes na trama B (ensaios de APTT). Todos os resultados representam uma determinação única. Os coeficientes de correlação de Pearson foram r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) e r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) para as relações com o MAA e aPTTassay, respectivamente. Reproduzido com a permissão de Inchiosa et al. 1
. Figura 2 Os resultados para as variações percentuais em tempos de coagulação nos ensaios de ponto-de-cuidado mostrados nas Figuras 1A e B são representados graficamente contra as concentrações plasmáticas de anti-factor Xa A resulta, MAA,. B, ensaios de aPTT. Todos os resultados são de ensaios únicos tempo de coagulação e determinações únicas de concentrações de anticorpos anti-factor Xa. Os coeficientes de correlação de Pearson foram r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) e r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) para as relações com o MAA eo ensaio de aPTT, respectivamente Reproduzido com a permissão de Inchiosa et al. 1
Discussion
Este ensaio de eficácia enoxaparina pode servir como uma alternativa importante para determinar a segurança relativa da realização de um procedimento invasivo que tem um risco inerente de hemorragia ou desenvolvimento de um hematoma. Isto seria de particular importância quando uma injecção epidural está a ser considerada. A maioria das diretrizes recomendam um período de espera de 12 horas entre a injecção de enoxaparina e início de um procedimento invasivo 5 Insuficiência renal, obesidade e gravidez podem influenciar os requisitos de administração de enoxaparina 6,7 Desde o ensaio pode ser concluído dentro de um 10.. - período min, poderia também ser utilizado numa clínica ou consultório médico, onde ele iria fornecer informação relativa ao nível de anticoagulação em pacientes que estão em risco de desenvolvimento de tromboembolismo venoso. Ajustes de dosagem imediata pode ser exercida, se necessário.
A concentração no plasma enoxaparina pode ser medido por um cromogénico umssay da extensão da inibição do factor de coagulação, Xa. No entanto, isso só produz a sua concentração não, especificamente a sua eficácia anti-coagulante, que varia amplamente entre os pacientes individuais. 6-8
Nossos estudos foram realizados apenas com enoxaparina. No entanto, pode prever-se que o ensaio pode ser aplicado a qualquer LMWH que é degradado por heparinase I. Isto já é conhecido por ser o caso para a dalteparina, nadroparina e tinzaparina. 9-11 Desenvolvemos o ensaio em relação às características de o instrumento Hemochron tempo de coagulação. O instrumento é relativamente barato, também, os tubos de sangue descartáveis coleta, ampola heparinase e cartuchos de ensaio para completar uma análise para um paciente é de aproximadamente 15 dólares. Assim, seria de esperar para ser adequado para monitorizar o estado anticoagulante em vários cenários clínicos.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
As investigações foram realizadas apenas com o apoio de recursos departamentais e institucionais. O aparelho de coagulação (Hemochron 801) foi emprestado, sem a obrigação do fabricante. Os cartuchos de ensaio foram comprados em seus custos de varejo. A figura introdutória em que o vídeo foi modificado a partir do Sanderink, et al. 12 A segunda figura no vídeo (heparinase curso de tempo de digestão) foi reproduzido com a permissão de Inchiosa et al. 1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
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