Summary
Demonstration einer raschen quantitativen Assay der Hemmung der Blutgerinnung durch den niedrigen Molekulargewicht-Heparin, Enoxaparin. Der Beitrag von Enoxaparin durch Entfernen seinen Einfluss durch Verdauung mit Heparinase beurteilt. Eine umfassendere Beschreibung des Tests wird in unserer veröffentlichten Papier detailliert.
Abstract
Es besteht das Bedürfnis nach einem klinischen Assay, um den Umfang, in dem Blut eines Patienten wirksam von der niedrigen Molekulargewicht-Heparin (LMWH), Enoxaparin ist antikoaguliert bestimmen. Es gibt auch dringende klinischen Situationen, wo es wichtig sein würde, wenn diese schnell ermittelt werden konnte. Der vorliegende Assay wurde entwickelt, um dies zu erreichen. Wir nur getestet menschlichen Blutproben, die mit bekannten Konzentrationen von Enoxaparin versetzt wurden. Das wesentliche Merkmal des vorliegenden Tests ist die Quantifizierung der Wirksamkeit von Enoxaparin in einer Blutprobe des Patienten durch Abbau von Inaktivität es mit Heparinase abzuschließen. Die mit Enoxaparin versetzt wurden; zwei Blutproben in Vacutainer-Röhrchen (Franklin Lakes, NJ Becton-Dickenson); gezogen wurden eine Probe wurde mit Heparinase für 5 min bei 37 ° C verdaut, repräsentiert die andere Probe des Patienten Basislinie antikoaguliertem Status. Die prozentuale Verkürzung der Gerinnungszeit in der Heparinase-behandelten Probe, wie zum Vergleich baseline Staat, ergab die gerinnungshemmende Beitrag von Enoxaparin. Wir verwendeten die tragbare, batteriebetriebene Hemochron 801 Vorrichtung zur Messung von Gerinnungszeiten (International Corp Technidyne, Edison, NJ). Die Vorrichtung hat zwei thermostatisch gesteuerten (37 ° C) Assay Rohrbrunnen. Wir haben die Assays in zwei Arten von Kassetten, die Assay beim Hersteller des Gerätes sind. Eine Patrone wurde modifiziert, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Wir entfernten das Kaolin aus der FTK-ACT Kartusche durch umfangreiche Spülen mit destilliertem Wasser, so dass nur die Glasoberfläche des Rohres, und vielleicht die Detektion Magneten als Aktivatoren. Wir nannten diese unsere minimal aktiviert Assay (MAA). Die Verwendung eines minimal aktiviert Assay wurde von uns und anderen untersucht. 2-4 Die zweite Patrone, die untersucht wurde eine aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) Assay (A104). Dies wurde als geliefert vom Hersteller verwendet. Die thermostatisiert Brunnen des Instruments werE für sowohl die Heparinase Verdauung und Koagulation Assays verwendet. Der Assay kann innerhalb von 10 min abgeschlossen. Der MAA-Assay zeigte robuste Veränderungen Gerinnungszeit nach Heparinase Verdauung von Enoxaparin über einen typischen klinischen Konzentrationsbereich. Mit 0,2 Anti-Xa IU pro ml Enoxaparin Blutprobe, verursacht Heparinase Verdauung eine mittlere Abnahme von 9,8% (20,4 sec) in Gerinnungszeit; bei 1,0 IU pro ml Enoxaparin gab es eine 41,4% ige Abnahme (148,8 sec). Dieser Bericht nur präsentiert die experimentelle Anwendung des Assays, dessen Wert in einem klinischen Umfeld muss noch eingerichtet werden.
Protocol
Ein. Heparinase Rekonstitution
- Lyophilisierte Heparinase I wird kommerziell (Siemens, Newark Delaware, DadeHepzyme REF B4240-10) in Fläschchen mit 1 ug des gereinigten Proteins erhalten. Das Protein wird in 0,25 ml Salzlösung (0,9% NaCl) gelöst.
2. Entnahme von Blutproben
- Zwei Blutproben werden durch Vakuum in Natriumcitrat (0,3 ml 0,109 M; 3,2%) gezogen gepufferten Vacutainer-Röhrchen (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ); die Rohre sowohl im Vorauflauf-Spike mit einer bekannten Konzentration von Enoxaparin, das Blutvolumen daß gezogen beträgt 2,7 ml. Der gesamte Inhalt ist dann 3,0 ml.
3. Heparinase Verdauung
- Der gesamte Inhalt des Fläschchens, die der Heparinase in eine Spritze (etwa 0,2 ml, 80% des Fläschchens; 0,8 ug Protein) abgesaugt werden kann, wird einem Vacutainer-Röhrchen überführt; 0,2 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) wird zugegeben das zweite Rohr, das als basel dientine Zustand vor Eliminierung der Enoxaparin-Effekt.
- Beide Vacutainer-Röhrchen werden in den Vertiefungen der thermostatisierten Hemochron Vorrichtung für einen Zeitraum von 5 min gegeben. (Die Angemessenheit einer 5 min Kochzeit mit Heparinase wurde in unserer bisher veröffentlichten Arbeiten etabliert. 1)
4. Gerinnungstests
- Am Ende des Heparinase Inkubation wird 2,0 ml Blut zur Probeneinsätzen übertragen. Im Fall des MAA Rohr, ist es mit 0,1 ml 250 mM CaCl 2, um die Koagulation zu initiieren vorgefüllt. Die kommerzielle aPTT Probeneinsätzen (A104) zur Einleitung in Vollblutgerinnungszeit das geworden Vacutainer-Röhrchen enthalten Natriumcitrat als Antikoagulans gezogen.
- Die Hemochron Gerät signalisiert den Abschluss der Blutgerinnung und bewahrt die Gerinnungszeiten in Sekunden. Der Unterschied in der Gerinnungszeiten zwischen der Heparinase-behandelten Probe und der Ausgangsprobe, die Gerinnungszeit ti geteiltme für die Baseline Probe, ergibt die prozentuale Abnahme durch Eliminierung von Enoxaparin. Wie unten diskutiert, haben starke lineare Korrelationen für die Beziehung zwischen prozentuale Abnahme der Gerinnungszeit und der Konzentration von Enoxaparin in versetzten Proben aus Vollblut, sowie für die Korrelation mit den gemessenen Konzentrationen von Enoxaparin durch die chromgenic worden Assay der Anti-Xa erhalten Aktivität. Anti-Xa-Assays von Enoxaparin Konzentration wurden mit einem kommerziellen Kit für einen zweistufigen chromogenen Assay (; Aniara, Mason, OH BIOPHEN) durchgeführt.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse für die Beziehungen zwischen der prozentualen Abnahme der Gerinnungszeit nach der Eliminierung von Enoxaparin mit Heparinase für eine Reihe von Dornen Konzentrationen von Enoxaparin (0,2, 0,4 und 1,0 Anti-Xa-IE pro ml). Die Ergebnisse werden sowohl für die MAA und aPTT Probeneinsätze vorgestellt. Die gemessenen Konzentrationen an Enoxaparin von chromogenen Assay von Anti-Xa-Aktivität sind ebenfalls in der Abszisse jeder Parzelle enthalten.
Abbildung 2 zeigt Diagramme der gleichen Daten wie prozentuale Abnahme der Gerinnungszeit vs chromogenen Maß für Anti-Xa-Aktivität.
Starke lineare Korrelationen, mit hoher statistischer Signifikanzen wurden für alle vier Beziehungen gefunden.
Abbildung 1. Point-of Care Bestimmungen Enoxaparin contribution um Gerinnungszeiten spiked Vollblut auf prozentuale Veränderung (Verkürzung) der Gerinnungszeit nach Inkubation mit Heparinase basiert. Die Stachelwalze Enoxaparin Konzentrationen zugegeben, um Vollblut und die gemessenen Anti-Xa-Plasmakonzentrationen (Mittelwert ± SE, in Klammern) sind in der Abszisse des Graphen angeordnet. Alle Änderungen in Prozent Gerinnungszeiten sind als Mittelwert und SE dargestellt, zusammen mit dem durchschnittlichen Verkürzung der Gerinnungszeit in Sekunden. Daten von dem gleichen Patienten sind durch gestrichelte Linien verbunden sind. Die Daten für die vier Patienten mit Sternchen in der Handlung identifiziert A (MAA Ergebnisse) sind die gleichen wie die vier Patienten in Kurve B (aPTT-Assays). Alle Ergebnisse stellen Einzelbestimmungen. Die Pearson Korrelationskoeffizienten r = 0,869 (p = 1,9 x 10 -5) und r = 0,916 (p = 2,8 x 10 -5) für die Beziehungen mit dem MAA und aPTTassay sind. Wiedergabe mit Genehmigung aus Inchiosa et al. 1
. Abbildung 2 Die Ergebnisse für die prozentualen Veränderungen der Gerinnungszeiten in den Point-of-Care-Tests in 1A & B gezeigt werden gegen Plasma Anti-Faktor-Xa Konzentrationen aufgetragen A, MAA Ergebnisse;. B, aPTT-Assays. Alle Ergebnisse sind aus einzelnen Gerinnungszeit-Assays und einzelne Bestimmungen der Anti-Faktor-Xa-Konzentrationen. Die Pearson Korrelationskoeffizienten r = 0,910 (p = 2,5 x 10 -6) und r = 0,922 (p = 2,0 x 10 -5) für die Beziehungen mit dem MAA-und aPTT-Assay, jeweils mit Zustimmung Inchiosa et al wiedergegeben. 1
Discussion
Dieser Assay von Enoxaparin Wirksamkeit kann als eine wichtige Option, um die relative Sicherheit der Durchführung einer invasiven Prozedur, die eine Begleitperson Blutungsrisiko oder Entwicklung eines Hämatoms ist festzustellen, dienen. Dies wäre besonders wichtig sein, wenn ein Epiduralinjektion erwogen wird. Die Mehrheit der Leitlinien empfehlen eine Wartezeit von 12 Stunden zwischen Injektion von Enoxaparin und Einleitung einer invasiven Verfahren fünf Nierenfunktion, Adipositas und Schwangerschaft kann die Dosierung Anforderungen der Enoxaparin beeinflussen 6,7 Da der Test innerhalb von 10 abgeschlossen werden kann.. - min Zeit, es könnte auch in einer Klinik oder Arztpraxis, wo sie Informationen über die Angemessenheit der Antikoagulation bei Patienten, bei denen ein Risiko der Entwicklung von venösen Thromboembolien sind bieten würde verwendet werden. Sofortige Dosisanpassung könnte eingeleitet werden, je nach Bedarf.
Die Enoxaparin-Konzentration im Plasma kann durch einen chromogenen einem gemessen werdenssay des Ausmaßes der Hemmung des Koagulationsfaktor, Xa. Allerdings ergibt dies nur seine Konzentration, die nicht speziell ihre gerinnungshemmende Wirkung, die weit variiert zwischen den einzelnen Patienten. 6-8
Unsere Untersuchungen wurden nur mit Enoxaparin durchgeführt. Es kann jedoch davon ausgegangen, dass der Assay irgendeinem NMH, die abgebaut Heparinase I. Dieses ist bereits bekannt, der Fall für Dalteparin, Nadroparin und Tinzaparin sein soll angewandt werden könnte. 9-11 Wir haben das Assay in Bezug auf die Merkmale Das HEMOCHRON Gerinnungszeit Instrument. Das Instrument ist relativ kostengünstig, auch die Einweg-Blutentnahmeröhrchen, Heparinase Ampulle, und Assay-Patronen, eine Analyse für einen Patienten ist etwa 15 $ abzuschließen. Somit wäre es zu erwarten, dass geeignet ist, den Status Antikoagulans in verschiedenen klinischen Situationen zu überwachen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Untersuchungen wurden ausschließlich mit Unterstützung von Abteilungs-und institutionellen Ressourcen durchgeführt. Die Koagulation Apparat (Hemochron 801) wurde unverbindlich vom Hersteller ausgeliehen. Die Assay-Patronen wurden bei ihren Privatkunden die Kosten gekauft. Der einleitende Figur in dem Video wurde von Sanderink, et al geändert. 12 Die zweite Zahl in dem Video (Heparinase Aufschlusszeit natürlich) mit freundlicher Genehmigung von Inchiosa et al reproduziert wurde. 1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepzyme | Siemens AG | B4240 | heparinase I |
| "MAA" cartridge | Technidyne | FTK-ACT | modified by kaolin removal |
| aPTT cartridge | Technidyne | A104 |
References
- Inchiosa, M. A. J. r, Pothula, S., Kubal, K., Sanchala, V. T., Navarro, I. Toward development of a point-of-care assay of enoxaparin anticoagulant activity in whole blood. J. Thromb. Thrombolysis. 32, 47-53 (2011).
- Despotis, G. J., Filos, K. S., Levine, V., Alsoufiev, A., Spitznagel, E. Aprotinin prolongs activated and nonactivated whole blood clotting time and potentiates the effect of heparin in vitro. Anesth. Analg. 82, 1126-1131 (1996).
- Pothula, S., Inchiosa, M. A. Jr, Sanchala, V. T., Sarabu, M., Inchiosa, A. S. In vitro effect of protamine excess on blood coagulation assays. Anesth Analg. 96, SCA39 (2010).
- Inchiosa, M. Jr, Pothula, S., Sanchala, V., Kubal, K. Detection of low plasma levels of low molecular weight heparin. Anesth Analg. 102, SCA10 (2010).
- Gogarten, W. The influence of new antithrombotic drugs on regional anesthesia. Curr. Opin. Anaesthesiol. 19, 545-550 (2006).
- Gouin-Thibault, I., Pautas, E., Siguret, V. Safety profile of different low-molecular weight heparins used at therapeutic dose. Drug Saf. 28, 333-349 (2005).
- Bazinet, A., Almanric, K., Brunet, C., Turcotte, I., Martineau, J., Caron, S., Blais, N., Lalonde, L. Dosage of enoxaparin among obese and renal impairment patients. Thromb. Res. 116, 41-50 (2005).
- El Rouby, S., Cohen, M., Gonzales, A., Hoppensteadt, D., Lee, T., Zucker, M. L., Khalid, K., LaDuca, F. M., Fareed, J. The use of a HEMOCHRON JR. HEMONOXTM point of care test in monitoring the anticoagulant effect of enoxaparin during interventional coronary procedures. J. Thromb. Thrombolysis. 21, 137-145 (2006).
- Yang, V. C., Bernstein, H., Cooney, C. L., Kadam, J. C., Langer, R. Removal of the anticoagulant activities of the low molecular weight heparin fractions and fragments with flavobacterial heparinase. Thromb Res. 44, 599-610 (1986).
- Maddineni, J., Walenga, J. M., Jeske, W. P., Hoppensteadt, D. A., Fareed, J., Wahi, R., Bick, R. L. Product individuality of commercially available low-molecular-weight heparins and their generic versions: therapeutic implications. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 12, 267-276 (2006).
- Wijnhoven, T. J., van de Westerlo, E. M., Smits, N. C., Lensen, J. F., Rops, A. L., vander Vlag, J., Berden, J. H., vanden Heuvel, L. P., van Kuppevelt, T. H. Characterization of anticoagulant heparinoids by immunoprofiling. Glycoconj. J. 25, 177-185 (2008).
- Sanderink, G. -J. C. M., Guimart, C. G., Ozoux, M. -L., Jariwala, N. U., Shukla, U. A., Boutouyrie, B. X. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of the prophylactic dose of enoxaparin once daily over 4 days in patients with renal impairment. Thromb. Res. 105, 225-231 (2002).
