תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה
Summary
נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.
Abstract
בעלי חיים לטעום הסביבה הריחנית סביבם דרך מערכות chemosensory ממוקמות בחלל האף. אותות Chemosensory להשפיע התנהגויות מורכבות כגון בחירת אוכל, טורף, conspecific והכרת בן זוג ורמזים חברתיים רלוונטיים אחרים. נוירונים קולטניים ריח (ORNs) ממוקמים בחלק הגבה של חלל האף המוטבע באפיתל ההרחה. הנוירונים דו קוטביים אלו שולחים אקסון לנורת חוש הריח (ראה איור. 1, Reisert & זאו 1, שפורסם במקור בכתב העת של פיזיולוגיה כללית) ולהרחיב דנדריט אחת לגבול אפיתל ממקום שבי להקרין ריסים לליחה המכסה את חוש הריח האפיתל. הריסים מכילים מנגנון העברת האותות שסופו של דבר מוביל לגירוי זרם זרם דרך ערוצי ריסי transduction, ערוץ מחזורי נוקלאוטיד-מגודר (CNG) וCa 2 +-Cl פעיל – ערוץ (1 איור). Depola התפתחrization מפעיל דור פוטנציאל פעולה בגוף התא 2-4.
בסרטון זה אנו מתארים את השימוש של "טכניקת יניקת פיפטה" לרשום תגובות odorant מושרים מORNs. שיטה זו פותחה במקור כדי להקליט מphotoreceptors המוט 5 וריאנט של שיטה זו ניתן למצוא בjove.com השונה כדי להקליט מphotoreceptors קונוס העכבר 6. טכניקת יניקת פיפטה מאוחר יותר הותאם גם להקליט מORNs 7,8. בקצרה, לאחר הניתוק של האפיתל ההרחה ובידוד תא, גוף התא כולו של orn נשאב לתוך קצה פיפטה הקלטה. דנדריט והריסים יישארו חשוף לפתרון אמבטיה ובכך נגיש לשינויי פתרון שיאפשר odorant למשל או יישום חוסם תרופתי. בתצורה זו, אין לו גישה לסביבה התאית היא צברה (לא מהדק מתח כל תאים) והמתח התאי נותר חופשי להשתנות. כל זהows ההקלטה סימולטני של זרם הקולט האיטי שמקורו בריסים ופוטנציאל פעולה מהיר שנורה על ידי גוף התא 9. ההבדל בקינטיקה בין שני אותות אלה מאפשר להם להיות מופרדים באמצעות גדרות מסננות שונות. טכניקה זו ניתן להשתמש בכל סוג פרא או עכבר נוקאאוט או להקליט באופן סלקטיבי מORNs שגם מבטא GFP לתייג תת ספציפי של ORNs, למשל מבטא קולט odorant נתון או ערוץ יון.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH DC009613, תכנית מדע הגבולות האנושית ומוראלית טיפול מלגה (לJR).
Materials
| Name of the material | Type | Company | Catalogue / Model number |
Comments |
| Air table | equipment | Newport | ||
| Air Pump | equipment | Newport | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom-made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn Hite corporation | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | WPI | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom-made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 |
equipment | Sutter Instrument | Micromanipulator MP85-1028 |
|
| Mineral oil | Solution | Sigma | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | Automate Scientific | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
