嗅覚受容ニューロン（ORNs）が受容体に最初のターンで嗅球の2次ニューロンに伝達される活動電位を引き起こすことを、現在の匂い信号を変換します。ここでは同時に匂い物質誘発性受容体マウスORNsから現在の活動電位を記録するための吸引ピペットのテクニックについて説明します。
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方法論記事
吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
動物は鼻腔に位置化学感覚系を介してそれらの周りに臭気環境をサンプリングする。化学感覚シグナルには、食べ物の選択、捕食動物、同種と認識メイトや他の社会的に関連する手がかりとして複雑な動作に影響を与えます。嗅覚受容ニューロン（ORNs）が嗅上皮に埋め込まれた鼻腔の背の部分に位置しています。これらのバイポーラニューロンは嗅球（ 図1参照 、もともと一般生理学のジャーナルで発表Reisert＆趙1）に軸索を送って、嗅覚をカバー粘液にどこ繊毛上皮から放射国境に単一の樹状突起を延ばす上皮。チャネル（ 図1） -繊毛は、最終的に毛様体伝達チャネル、環状ヌクレオチド依存性（CNG）をチャネルとCa 2 +活性化Clを通る電流の流入を興奮につながるシグナル伝達機構が含まれています。その後depolarizationは、細胞体2から4で活動電位の発生をトリガーします。
このビデオでは、ORNsから匂い物質誘発性の応答を記録するための "吸引ピペット技術"の使用方法について説明します。このメソッドは当初、桿体5から記録するために開発され、この方法の変形例は、マウスの錐体6から記録するように修正jove.comで見つけることができます。吸引ピペット技術は後でまたORNs 7,8から録音するように適合された。簡単に言えば、嗅上皮と細胞単離の解離後、ORNの全体の細胞体は、記録ピペットの先端に吸引される。デンドライトと繊毛は浴溶液にさらされると、例えば匂い物質または薬理ブロッカーアプリケーションを有効にするソリューションの変更することがアクセス可能な状態のままです。この構成では、細胞内環境へのアクセスが得られません（無細胞全体の電圧クランプ）と細胞内の電圧が変化すること自由に残っています。これは、すべて繊毛と細胞体9によって発射速い活動電位を起点遅い受容体電流の同時記録をOWS。これらの2つの信号間の動態の違いは、それらが異なるフィルタ設定を使用して分離することができるようになります。この手法は、任意の野生型またはノックアウトマウスで使用することができますまたはもORNsの特定のサブセットを標識するためにGFPを発現ORNsから選択的に記録するために、例えば与えられた嗅覚受容体やイオンチャネルを発現している。
プロトコル
1。録画設定
記録室はエアテーブル上に取り付けられ、電気的にファラデーケージを使用してシールドされている位相差光学ニコンTE2000U Eclipseの倒立顕微鏡に搭載されている。プレキシガラスの記録室には2つのセクションが部分的障壁によって分離し、シラン化スライドガラス上に接着で構成されています。他の着臭剤にはまだ決着が使用されていない細胞の早期の曝露を最小限にするために記録中に刺激露光に使用されている間、チャンバの1つのセクションのセルを解決するために使用されます。録画設定をペレットピペットホルダ及び接地電極に取り付けられた吸引ピペット（下記参照）で構成されています。吸引ピペットはマイクロマニピュレーターを使用して配置されています。スティミュラス·ソリューションは、それぞれの正方形の管が0.7ミリメートル×0.7ミリメートルであることと、トリプルバレルガラス正方形の管を使用して適用されます。トリプルバレルガラスがマニピュレータに搭載された電動の高速ステップ灌流システム（SUTに接続されていたTER SF-77B、ワーナー·インスツルメンツ）や〜45°の角度で記録室に入った。トリプルバレルガラスの端はトリプルバレルガラスの最終面（開口部）がピペットの緊密な位置決めを可能にするために、垂直となるように再び45°の角度で面取りした。
標準哺乳類リンゲル液及び接地電極でいっぱい吸引ピペット電極電圧クランプモードでパッチクランプア....
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ディスカッション
吸引ピペット技術が同時にORNから臭気誘起遅い受容体電流と高速二相性活動電位を記録するために使用される電気生理学的な手法である。細胞の形質膜が破られていないので、この方法は、付臭剤応答が細胞内因子の細胞質イオン濃度または希釈の変化に起因する変更されていないことを確実に邪魔されずに細胞内の環境を残します。細胞は、長期間（マウスの中の蛙と1時間で最大4時間）のから録音することができます。細胞体は記録ピペットの内側にあるので、この手法のもう一つの利点は、刺激が唯一ORNの先端部に配信されていること、そうであるように繊毛や樹状ノブ（IEです）このように、セル全体が露出した場合に発生する可能性の非特異的効果を排除。セルは比較的よくピペット、高い溶液流量の先端に安定座っにより保護されていますので、高速なソリューションの変更を達成することができるとしても、高流量が簡単にシールが失われる可能性がありタイトなシール記録構成に比べ。細胞内のアクセスが得られていないので、逆に、この技術は研究電位依存性電流をEGにセル電圧クランプするために使用することはできません。それが緩んシール技術であるため、また、録音は様々なソ.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
この作品は、NIH DC009613、ヒューマンフロンティア·サイエンス·プログラムとモーリーケアフェローシップ（JRに）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 材料の名称 | タイプ | 会社 | カタログ/ 型番 | 注釈 |
| 空気テーブル | 機器 | ニューポート | ||
| 空気ポンプ | 機器 | ニューポート | ACGP | |
| ピペットプラー | 機器 | サッター | P-97 | |
| ホウケイ酸ガラス | 機器 | WPI | 1B150-4 | |
| ニコン倒立顕微鏡エクリプス | 機器 | ニコン | TE2000U | Hgランプ、GFPフィルターや目標少なくとも20Xと5X装備 |
| アンプのPC-501A | 機器 | ワーナー | 64から0008 | ヘッドステージ1GΩ |
| ダイヤモンドナイフ | 機器 | カスタムメード | ||
| デジタイザMikro1401、A / D | 機器 | ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン | ||
| フィルタユニット3382 | 機器 | クルーンハイト法人 | ||
| 信号 | ソフトウェア | ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン | ||
| Ag / AgCl電極ペレット成形 | 機器 | WPI | 64から1297 | |
| ピペットホルダ | 機器 | ワーナー | 64から0997 | カスタムは、適合するように変更 ヘッドステージ |
| 記録室 | 機器 | カスタムメード | ||
| 極微操作装置 MP85-1028 | 機器 | サター·インストゥルメント | 極微操作装置 MP85-1028 | |
| 鉱油 | ソリューション | シグマ | 330779-1L | |
| オシロスコープのTDS 1001 | 機器 | テクトロニクス | ||
| 三連発四角いガラス管 | 機器 | ワーナー | 64から0119 | 5センチメートル長い0.6ミリメートルのID、 |
| バルブ | 機器 | リー·カンパニー | ||
| Valvelink 8.2 | 機器 | 科学自動化 | ||
| SF-77B潅流高速ステップ | 機器 | ワーナー |
参考文献
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
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再版と許可
