Odorant induites réponses enregistrées à partir de neurones récepteurs olfactifs en utilisant la technique de la pipette d'aspiration

Summary

Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) convertir les signaux d'odeurs dans un premier récepteur de courant qui à son tour déclenche des potentiels d'action qui sont acheminés à des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif. Ici, nous décrivons la technique pipette d'aspiration d'enregistrer simultanément le récepteur olfactif courant induit et des potentiels d'action de ORNs souris.

Abstract

Animaux échantillonner l'environnement odorant autour d'eux à travers les systèmes chimiorécepteurs situés dans la cavité nasale. Signaux chimiosensoriels affectent les comportements complexes tels que le choix des aliments, prédateur, conspécifiques et la reconnaissance compagnon et d'autres indices socialement pertinents. Neurones récepteurs olfactifs (ORNs) sont situés dans la partie dorsale de la cavité nasale noyée dans l'épithélium olfactif. Ces neurones bipolaires envoyer un axone vers le bulbe olfactif (voir Fig. 1, Reisert & Zhao ^1, initialement publié dans le Journal of General Physiology) et d'étendre une dendrite unique à la frontière épithéliales de rayonner cils où dans le mucus qui recouvre la olfactif épithélium. Les cils contenir le mécanisme de transduction du signal qui mène à excitateurs afflux de courant à travers les canaux de transduction ciliaire, un nucléotide cyclique-dépendant (CNG) et un canal de Ca ^{2 +-Cl} actif ^– canal (Fig. 1). Le depola qui a suivirisation déclenche la génération du potentiel d'action sur le corps ^{2-4 Cellules.}

Dans cette vidéo, nous décrivons l'utilisation de la "technique d'aspiration pipette" pour enregistrer odorant réponses induites à partir ORNs. Cette méthode a été développée à l'origine pour enregistrer à partir photorécepteurs à bâtonnets ⁵ et une variante de cette méthode peut être trouvé à jove.com modifié pour enregistrer à partir de cônes photorécepteurs de souris ^6. La technique pipette d'aspiration a été adapté plus tard pour également enregistrer à partir ORNs ^7,8. Brièvement, après dissociation de l'épithélium olfactif et d'isolement des cellules, le corps de la cellule entière d'une ORN est aspiré dans la pointe de la pipette d'enregistrement. La dendrite et les cils restent exposées à la solution de bain et donc accessible à des changements de solution pour permettre par exemple odorant ou une application de blocage pharmacologique. Dans cette configuration, pas d'accès à l'environnement intracellulaire est acquise (pas de blocage de tension de cellule entière) et la tension intracellulaire reste libre de varier. Tout celaux l'enregistrement simultané du courant qui provient du récepteur lent à des cils et des potentiels d'action rapide tiré par le corps ⁹ cellules. La différence de cinétique entre ces deux signaux permet de les séparer en utilisant différents paramètres de filtre. Cette technique peut être utilisée sur n'importe quel type sauvage ou de la souris knock-out ou d'enregistrer de manière sélective à partir ORNs qui expriment la GFP également d'étiqueter des sous-ensembles spécifiques de ORNs, par exemple, l'expression d'un récepteur olfactif donnée ou canal ionique.

Protocol

1. La Recording Setup La chambre d'enregistrement est montée sur un microscope inversé Nikon Eclipse TE2000U avec optique à contraste de phase qui est monté sur une table pneumatique et électrique blindé avec une cage de Faraday. La chambre d'enregistrement Plexiglas compose de deux sections partiellement séparés par une barrière et collé sur une lame de verre silanisée. Une section de la chambre est utilisée pour régler les cellules tandis que l'autre est utilisé pou…

Discussion

<p class="jove_content"> La technique pipette d'aspiration est une méthode électrophysiologique qui est utilisé pour enregistrer le courant induit par l'odeur récepteur lent et les potentiels d'action rapide biphasiques à partir d'un ORN simultanément. Depuis la membrane plasmique de la cellule ne soit pas dépassé, cette méthode laisse le milieu intracellulaire non perturbé en sorte que les réponses odorantes ne sont pas altérées en raison de changements des concentrations d'ions cytoplasmiques ou de dilution…

Materials

Name of the material	Type	Company	Catalogue / Model number	Comments
Air table	equipment	Newport
Air Pump	equipment	Newport	ACGP
Pipette Puller	equipment	Sutter	P-97
Borosilicate glass	equipment	WPI	1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope	equipment	Nikon	TE2000U	Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A	equipment	Warner	64-0008	Headstage 1 GΩ
Diamond knife	Equipment	Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D	equipment	Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382	equipment	Krohn Hite corporation
Signal	software	Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet	equipment	WPI	64-1297
Pipette holder	equipment	Warner	64-0997	Custom modified to fit headstage
Recording chamber	Equipment	Custom-made
Micromanipulator MP85-1028	equipment	Sutter Instrument	Micromanipulator MP85-1028
Mineral oil	Solution	Sigma	330779-1L
Oscilloscope TDS 1001	equipment	Tektronix
Three-barreled square glass tube	Equipment	Warner	64-0119	0.6 mm ID , 5 cm long
Valve	equipment	The Lee Company
Valvelink 8.2	equipment	Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step	equipment	Warner