Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Summary

Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.

Abstract

Animali campionare l'ambiente intorno odorosa attraverso i sistemi chemiosensoriali situati nella cavità nasale. Segnali chemiosensoriali influenzare comportamenti complessi come la scelta degli alimenti, predatore, conspecifici e il riconoscimento mate e altri segnali socialmente rilevanti. Neuroni recettori olfattivi (ORNs) sono situati nella parte dorsale della cavità nasale incorporato nell'epitelio olfattivo. Questi neuroni bipolari inviare un assone al bulbo olfattivo (vedi fig. 1, Reisert & Zhao ^1, originariamente pubblicato nella Gazzetta di Fisiologia Generale) e di estendere un singolo dendrite al confine epiteliale da cui si irradiano le cilia nel muco che copre l'olfatto epitelio. Le ciglia contiene il macchinario di trasduzione del segnale che porta infine al eccitatori afflusso di corrente attraverso i canali di trasduzione ciliari, un ciclico nucleotide-gated (CNG) e un canale Ca ^{2 +-attivata} Cl ^– canale (Fig. 1). Il depola conseguenterizzazione innesca generazione potenziale d'azione al corpo cellulare ^2-4.

In questo video si descrive l'uso della "tecnica di aspirazione pipetta" per registrare odorizzante risposte indotte da ORNs. Questo metodo è stato originariamente sviluppato per registrare da bastoncelli ⁵ e una variante di questo metodo può essere trovato alla jove.com modificato per registrare da fotorecettori cono del mouse ^6. La tecnica pipetta di aspirazione è stato in seguito adattato per registrare anche da ORNs ^7,8. Brevemente, dopo dissociazione dell'epitelio olfattivo e isolamento cellulare, il corpo intera cella di un ORN viene aspirato nella punta di una pipetta di registrazione. Il dendrite e le ciglia rimangono esposti alla soluzione del bagno e quindi accessibili a soluzione cambia per abilitare odorizzante es o applicazione bloccante farmacologica. In questa configurazione, nessun accesso all'ambiente intracellulare viene acquisita (non whole-cell voltage clamp) e la tensione intracellulare rimane libero di variare. Tutto questodeve il la registrazione simultanea della corrente recettore lento che ha origine alla ciglia e potenziali d'azione veloci generati dal corpo cellulare ^9. La differenza nella cinetica tra questi due segnali permette loro di essere separati mediante diverse impostazioni di filtro. Questa tecnica può essere utilizzato su qualsiasi tipo selvaggio o di topo knockout o per registrare selettivamente da ORNs anche che esprimono GFP etichettare specifici sottoinsiemi di ORNs, ad esempio esprimere un recettore olfattivo dato o canale ionico.

Protocol

1. Il programma di installazione di registrazione La camera di registrazione è montata su un microscopio invertito Nikon TE2000U Eclipse con ottica di contrasto di fase che è montato su un tavolo aria e schermati elettricamente usando una gabbia di Faraday. La camera di registrazione Plexiglass consiste di due sezioni parzialmente separate da una barriera e incollato su un vetrino silanizzato. Una sezione della camera è utilizzato per regolare le cellule, mentre l'altro viene utilizzato…

Discussion

<p class="jove_content"> La tecnica pipetta di aspirazione è un metodo elettrofisiologico che viene utilizzato per registrare l'odore indotta corrente lenta recettore e le potenziali veloce azione bifasici da un ORN simultaneamente. Poiché la membrana plasmatica della cellula non è violato, questo metodo lascia l'ambiente intracellulare indisturbata garantire che le risposte odorizzante non sono alterati a causa di cambiamenti delle concentrazioni degli ioni citoplasmatici o di diluizione di fattori intracellulari. Le cellule poss…

Materials

Name of the material	Type	Company	Catalogue / Model number	Comments
Air table	equipment	Newport
Air Pump	equipment	Newport	ACGP
Pipette Puller	equipment	Sutter	P-97
Borosilicate glass	equipment	WPI	1B150-4
Nikon Eclipse Inverted microscope	equipment	Nikon	TE2000U	Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least
Amplifier PC-501A	equipment	Warner	64-0008	Headstage 1 GΩ
Diamond knife	Equipment	Custom-made
Digitizer Mikro1401 A/D	equipment	Cambridge Electronic Design
Filter unit 3382	equipment	Krohn Hite corporation
Signal	software	Cambridge Electronic Design
Molded Ag/AgCl Pellet	equipment	WPI	64-1297
Pipette holder	equipment	Warner	64-0997	Custom modified to fit headstage
Recording chamber	Equipment	Custom-made
Micromanipulator MP85-1028	equipment	Sutter Instrument	Micromanipulator MP85-1028
Mineral oil	Solution	Sigma	330779-1L
Oscilloscope TDS 1001	equipment	Tektronix
Three-barreled square glass tube	Equipment	Warner	64-0119	0.6 mm ID , 5 cm long
Valve	equipment	The Lee Company
Valvelink 8.2	equipment	Automate Scientific
SF-77B Perfusion fast step	equipment	Warner