Summary
In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid van recombinante eiwitten.
Abstract
Recombinant eiwitexpressie in bacteriën, meestal E. coli, is de meest succesvolle strategie voor milligram hoeveelheid expressie van eiwitten. Echter prokaryotische gastheren vaak minder geschikt voor expressie van humane, virale of eukaryotische eiwitten door toxiciteit van buitenlandse macromolecuul, verschillen in de eiwitvouwing machine, of door het ontbreken van bepaalde co-of post-translationele modificaties in bacteriën. Expression systemen op basis van gist (P. pastoris of S. cerevisiae) 1,2, baculovirus geïnfecteerde insecten (S. frugiperda of T. ni) cellen 3, en celvrije in vitro vertaalsystemen 2,4 zijn met succes gebruikt om de produceren zoogdiereiwitten. Intuïtief de beste overeenkomst is een warmbloedige gastheer gebruikt om de productie van recombinante eiwitten die de juiste post-translationele modificaties bevatten waarborgen. Een aantal zoogdierlijke cellijnen (humane embryonale Kidney (HEK) 293 zijn C V-1 cellen O rigin die de S V40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovarium (CHO), en anderen) succes gebruikt om milligram hoeveelheden van een aantal humane eiwitten tot overexpressie 5-9. Echter de voordelen van zoogdiercellen vaak tegen hogere kosten vereist gespecialiseerde laboratoriumapparatuur lagere eiwitopbrengsten en lange tijd om stabiele cellijnen te ontwikkelen expressie. Het verhogen van de opbrengst en de productie van eiwitten sneller, terwijl de kosten laag zijn, zijn belangrijke factoren voor veel academische en commerciële laboratoria.
We beschrijven hier een tijd-en kosten-efficiënte, tweedelige procedure voor de expressie van uitgescheiden menselijke eiwitten van vreemde HEK 293T-cellen. Dit systeem is geschikt voor het produceren microgram tot milligram hoeveelheden van functionele eiwitten voor structurele, biofysische en biochemische studies. Het eerste deel, meerdere constructen van het gen van belang te producerend in parallel en tijdelijk getransfecteerd in adherente HEK 293T-cellen in kleine schaal. De detectie en analyse van recombinant eiwit uitgescheiden in het celkweekmedium wordt door western blot analyse in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen een vector gecodeerd eiwit zuivering tag. Vervolgens worden geschikt constructen voor grootschalige productie van eiwitten transient getransfecteerd met polyethyleenimine (PEI) in 10 laag celfabrieken. Eiwitten uitgescheiden in liter-volumes van geconditioneerd medium zijn geconcentreerd in hanteerbare hoeveelheden met behulp van tangentiële flow filtratie, gevolgd door zuivering door anti-HA-affiniteitschromatografie. Het nut van dit platform wordt bewezen door het vermogen om milligram hoeveelheden cytokines, cytokine receptor celoppervlakreceptoren, intrinsieke beperking factoren en virale glycoproteïnen drukken. Deze methode is ook met succes gebruikt in de bepaling van de structurele trimere ebolavirus glycoproteïne 5,10.
2 incubator, vereist. Deze procedure kan snel worden uitgebreid systeem van grotere complexiteit, zoals co-expressie van eiwitcomplexen, antigenen en antistoffen productie van virusachtige deeltjes voor vaccins of productie van adenovirussen of lentivirussen voor transductie van moeilijk cellijnen.
Protocol
1. Voorbereiding werk - constructen en celculturen
Voordat het protocol zou het gen van belang zijn codon geoptimaliseerd voor expressie in zoogdiercellen en gekloneerd in een geschikte expressievector gebruikmaking van standaard moleculair-biologische technieken. Om de hoogste kans op succesvolle expressie te garanderen, moet meerdere varianten van het gen van belang worden gegenereerd. Veel zoogdieren expressievectoren zijn in de handel verkrijgbaar en hebben verschillende zuivering tags (polyhistidine, hemagglutinine, streptavidine, HALO-Tag, glutathion S-transferase, onder anderen). Wij geven de voorkeur aan de pDISPLAY vector die codeert voor een sterke humaan cytomegalovirus promotor, een secretiesignaal Ig κ, hemagglutinine zuivering tag, en een C-terminale transmembraan anker tegen het eiwit gericht door de secretieroute voor weergave op de plasmamembraan. We gewoonlijk plaats een stopcodon voor de vector gecodeerde transmembraan verankeringr om het eiwit uitgescheiden in het geconditioneerde medium.
Menselijke embryonale nier (HEK) 293T-cellen zijn op grote schaal beschikbaar en gemakkelijk gekweekt en getransfecteerd. HEK 293T worden gewoonlijk gebruikt voor de expressie van eiwitten van zoogdieren, maar worden beschouwd als biologisch gevaarlijk en moeten worden behandeld op bioveiligheidsniveau 2. Draag de juiste persoonlijke beschermende kleding; werk moet worden uitgevoerd in een goedgekeurde bioveiligheid kabinet met een aseptische techniek. Al het afval en de oppervlakken moeten worden gedesinfecteerd volgens de institutionele en bestuurlijke richtlijnen. Het verdient aanbeveling dat cellen worden getest mycoplasma verontreinigingen gebruiken. Cellen kunnen worden behandeld met Ciprofloxacine (10 ug / ml) gedurende tien dagen elke bron van mycoplasma spp roeien. verontreiniging. Algemene protocollen bij HEK 293T-cellen vermeerderen worden afzonderlijk gepresenteerd (Box 1).
Aanvullende overwegingen voor test-en grootschalige eiwitexpressie zijn reviewed in 11-15.
2. Kleinschalige Test Expression
Zodra constructies zijn ontworpen en geproduceerd, testopstellingen op kleine schaal transfecties kan worden uitgevoerd met behulp van HEK 293T-cellen; een schematisch overzicht van het proces wordt hieronder weergegeven (afb. 1).
- Gebruik T75 cm 2 of T225 cm2 celkweek kolven (afhankelijk van het aantal testen uitdrukkingen worden uitgevoerd) voor de HEK 293T cellen groeien en de cellen verdeeld elke 2-3 dagen wanneer cellen 100% confluent (Box 1).
- Zaad 2,5 x 10 5 HEK 293T cellen per putje in een 6-wells plaat en 2 ml DMEM met 1X pen / strep en 10% (v / v) FBS, zwenk de plaat zacht zelfs cellen dispersie in elk putje te waarborgen, en incubeer overnacht bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde kamer.
- Bij het HEK 293T-cellen tot 40% confluentie, gooi de media en voeg verse 2 ml DMEM met 1X pen / strep en 10% (v / v) FBS aan de putjes. Uitvoerentransfectie assays.
- Aliquot 90 pi serum-vrij DMEM in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuisje. Pipetteer 3 ul GeneJuice in het serum-vrij DMEM en meng de buis (vinger vortex). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 ug Miniprep gezuiverd plasmide DNA (DNA voorraad = 100 ng / pl) in DMEM-GeneJuice mengsel vinger vortex en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Pipetteer de transfectiemix druppelsgewijs op HEK 293T cellen en zwenk de 6-well plaat zachtjes een gelijkmatige verdeling van de transfectiemix mogelijk. Incubeer de 6-wells plaat bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde kamer.
- Voeg 1 ml vers DMEM met 1X pen / strep en 10% (v / v) aan elk FBS en 24 uur na transfectie en incubeer nog 48 uur (totaal 72 uur).
- Oogst 1 ml van het supernatans van elk putje drie dagen na transfectie en microcentrifuge de monsters bij 16.000 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voer western blot-analyse zoals beschreven in box 2. Monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C. De lengte van bewaren bij 4 ° C eiwit afhankelijk.
3. Grootschalige Test expressie en zuivering
Zodra een construct is vastgesteld milligram hoeveelheid expressie van recombinant eiwit wordt bereikt door PEI transfectie van hechtende HEK 293T cellen met 10 lagen celfabrieken (Fig. 2; 6360 cm2 specifiek oppervlak). Voor meer verkennende studies, kunnen kleinere cel fabrieken of T-kolven (tabel 1) worden gebruikt.
- Zuiver 1 mg van DNA voor transfectie met een plasmide MaxiPrep zuivering kit. Een 500 ml nacht cultuur XL-1 Blauwe cellen te produceren ten minste 1 mg zuiver DNA. Controleer zuiverheid van DNA door meting A 260 / A 280 verhouding; moet boven 1,8.
- Schaal HEK 293T cellen 2,0 x 10 8 cellen. Elke T225 cm2 fles gegroeid tot 100% confluentie contains en gemiddeld 2,25 x 10 ~ 7 cellen.
- Voeg 1,2 L DMEM met 5% (v / v) FBS een 10 laag cel fabriek. Voeg 2,0 x 10 8 HEK 293T cellen de cel fabriek verdelen cellen alle lagen van het vaartuig. Het is zeer moeilijk te visualiseren van cellen confluentie in de cel fabriek. Als alternatief, het opzetten van een T75 cm2 fles met een geschikt aantal cellen met dezelfde cel nummer oppervlakte verhouding als uitgevoerd bij de 10 laag vat. Monitor deze kolf voor de groeicijfers. Zie de bijbehorende video voor instructies over de behandeling van de cel als fabriek. Incubeer nacht bij 37 ° C met 5% CO2 om voor celhechting en groei.
- Voer grootschalige transfectie wanneer adherente HEK 293T-cellen zijn 70% confluent. Bereid de PEI-DNA transfectie mengsel (3:1 w / w PEI aan DNA-ratio) in een bioveiligheid kast met een steriele T75 cm 2 kolf. Meng 0,84 mg DNA met 84 ml steriele 1X PBS, voeg 2,5 ml PEI (2.5 mg totaal PEI). Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Oplossing dient te troebel wordt.
- Giet het PEI-DNA transfectie mengsel in de cel fabriek volledig verdelen over alle lagen van het vaartuig. Optioneel: voor de verhoogde expressie opbrengst, voeg valproïnezuur (4 mM eindconcentratie). Incuberen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende vier dagen.
- Oogst supernatant vier dagen na transfectie. Centrifugeer de geconditioneerde media bij 6000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Verder filter de supernatant met een 0,22 pm Stericup vacuum filterinrichting. De 10-laag cel als fabriek kunnen worden hergebruikt, zie box 3 voor het reinigen van instructies. Het is belangrijk dat de reiniging direct wordt gestart na supernatant oogst; laat de cellen droog op het schip oppervlak.
- Concentreer de supernatant 75 ml met de Centramate tangentiële stroming filtratie.
- 500 ml PBS en opnieuw geconcentreerd tot 75 ml. Herhaal dit drie Additional keer volledig te bufferen wisselen het monster.
- Evenwicht een 1 ml anti-HA affiniteitskolom met 1X PBS en toepassing geconcentreerde monster door zwaartekrachtstroming een snelheid <1 ml / min.
- Was de kolom met 30 ml 1X PBS-Tween20.
- Los HA peptide in 1X PBS (1,0 mg / ml) en incuberen bij 37 ° C.
- Breng 1 ml van de HA peptide aan het anti-HA kolom en laat het peptide te gaan in de hars. Verzamel de stroom door. Stop de stroom wanneer het peptide oplossing de bedhoogte bereikt.
- Incubeer de gehele anti-HA kolom bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Herhaal stap 12 twee maal.
- Breng 1 ml PBS 1X de anti-HA kolom en uitmonden in de hars tot in de bedhoogte. Verzamel de stroom door.
- Regeneratie van de anti-HA kolom met 10 ml 0,1 M glycine pH 2,2. Wassen met 10 ml PBS en op te slaan affiniteitskolom bij 4 ° C in PBS met 0,02% (w / v) NaN3.
- Voer SDS-PAGE-analyse en het zwembad van de fractions aangepast. Opmerking: De HA peptide zal met eiwit concentratie metingen verstoren door A 280 of Bradford. Om de hoeveelheid eiwit aanwezig belasting 5, 10, 15, 25 ug BSA schatten op de SDS-PAGE gel als een standaard en vergelijkt de band intensiteit.
Stappen 9-17 kan worden herhaald om extra proteïne vangen van het geconditioneerde medium.
4. Representatieve resultaten
In dit artikel beschrijven we en demonstreren van een geschikte expressie platform voor milligram-hoeveelheid productie van menselijke eiwitten die vervolgens gebruikt kunnen worden voor structurele en functionele studies. Het screenen van humaan eiwit constructen gebruikt HEK 293T cellen in 6-wells platen effectief en efficiënt in identificeren constructen vatbaar grotere schaal. Commerciële expressievectoren efficiënt kunnen worden getransfecteerd in HEK 293T cellen met verschillende transfectie reagentia zoals GeneJuice, Fugene HD PE of I. Wij raden het gebruik van een commerciële transfectie reagens, zoals GeneJuice of Fugene HD, voor de test uitdrukkingen, omdat deze reagentia zijn effectiever voor de armere uiten eiwitten (afb. 3). Constructen geselecteerd voor grotere expressie worden gekenmerkt door een, sterke band, overeenkomend met de juiste molecuulgewicht op western blot (Fig. 3). Glycoproteïnen kunnen migreren als een bredere band als gevolg van heterogeniteit in glycosylering. We hebben aangetoond dat een verscheidenheid van macromoleculen, van virale glycoproteïnen, cytokines, cytokine receptoren en andere oppervlakte-eiwitten, kan worden en gezuiverd millgram hoeveelheden eiwit met de algemene uitdrukking platform (Fig. 4) op te leveren.
Figuur 1. Workflow schema van kleinschalige transfecties.tp_upload/4041/4041fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.
Figuur 2. Corning 10-laag CellStack voor grotere schaal eiwitexpressie. Elke laag bevat 636 cm 2 oppervlakte voor celhechting. Een standaard laboratorium CO 2 incubator (6,0 cu. Ft) zal comfortabel plaats voor vier 10-laags cel fabrieken.
.. Figuur 3 Kleinschalige expressie van verschillende uitgescheiden eiwitten We voerden een reeks van testopstellingen op kleine schaal uitdrukkingen gebruik van gemeenschappelijke transfectiereagentia:. GeneJuice, Fugene HD en PEI (a) Western blot screening van geselecteerde humane cellulaire eiwitten (tetherin), receptoren (IL-2R β subunit) en cytokinen (IL-2). Tetherin is een menselijke membraan glycoproteïne dat de release van beperktopkomende HIV-1 virions 16. De extracellulaire domein van tetherin bestaat als een geglycosyleerd, disulfide-gebonden dimeren van ~ 36 kDa. Onder reducerende omstandigheden, zoals hier getoond, tetherin migreert als een monomeer met een schijnbaar molecuulgewicht van 22 kDa ~. Interleukine-2 (IL-2) is een cytokine (~ 17 kDa) betrokken bij lymfocytproliferatie 17. Interactie met het IL-2 receptor complex, waarbij IL-2R βsubunit (~ 26 kDa) een component 18. CD21 een membraan eiwit betrokken bij de activering en rijping B-cellen door het complement systeem en ook een receptor voor het Epstein-Barr virus. De geglycosyleerde extracellulaire domein van CD21 migreert als een monomeer met een schijnbaar molecuulgewicht van 20 kDa ~. (B) Western blot screening gekozen oppervlak virale glycoproteïnen (XMRV Env en ebolavirus GP). XMRV en ebolavirus glycoproteïnen (transmembraan anker verwijderd) bestaan op het virale membraan als trimere pieken en worden betrokken bij de gastheercel bijlageen fusion. De ectodomein van XMRV Env en EBOV GP zijn zwaar gedecoreerd met N-gekoppelde glycanen en migreren op schijnbaar moleculair gewicht van 70 kDa en 75 kDa, respectievelijk.
Figuur 4. Gezuiverde menselijke cellulaire eiwitten van grootschalige HEK 293T culturen. Alle eiwitten werden tot expressie gebracht met een 10 laag cel fabriek, geconcentreerd en gezuiverd door anti-HA chromatografie. Zoals blijkt uit Coomassie-gekleurde SDS-PAGE analyse van de extracellulaire domeinen van de interleukine-2 receptor (IL-2R) α en γ subeenheden migreren molecuulgewicht van 40 kDa en 46 kDa, respectievelijk. De extracellulaire domein van tetherin migreert een dimeer onder niet-reducerende omstandigheden met een schijnbaar molecuulgewicht van 36 kDa. Merk op dat er een BSA verontreinigingen die verschijnt een schijnbaar molecuulgewicht van 60 kDa. Bovendien de heterogeniteit van de N-gekoppelde glycanen presenteren tetherin,IL-2R α en IL-2R γ oorzaken bandverbreding de SDS-PAGE gel. Deze complex-type N-gekoppelde glycanen kunnen worden verwijderd met peptide: N-glycosidase F.
| Vat | Oppervlakte |
| 6-well plaat | 9,5 cm 2 (elk putje) |
| 100 mm schaaltjes | 55 cm 2 |
| 245 mm schaaltjes | 500 cm2 |
| T75 cm2 fles | 75 cm2 |
| T175 cm2 fles | 175 cm2 |
| T225 cm2 fles | 225 cm 2 |
| Roller fles-reguliere | 850 cm 2 |
| Roller fles uitgebreide oppervlak | 1700 cm 2 |
| Een laag CellStack | 636 cm 2 |
| 2-laags CellStack | 1272 cm 2 |
| 5-lagen CellStack | 3180 cm 2 |
| 10 laag CellStack | 6360 cm 2 |
| 40 laag CellStack | 25.440 cm 2 |
Tabel 1. Vergelijking van de celcultuur schepen voor de eiwitexpressie.
Lijst van Reagens Recepten
100X ciprofloxacine Voor 10 ml, oplossing, voeg 10 ml gedeïoniseerd water tot 10 mg ciprofloxacine. Voeg 10 ul 6N HCl volledig op te lossen van de ciprofloxacine.
PEI (1 mg / ml) 100 ml oplossing wordt 100 mg van 25 kDa lineaire PEI in gedeïoniseerd water en verhit tot 80 ° C. Cool oplossing op kamertemperatuur, de pH instellen op 7,2, 0,22 urn filter steriliseren, hoeveelheid en invriezen bij -20 ° C voor long-termijn opslag.
1X PBS Voor 1 L waterige oplossing: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 (watervrij), 0,24 g KH 2 PO 4. Pas de pH van de oplossing tot 7,4 en vul tot 1,0 L.
1X PBS-Tween-20 Voor 1 liter waterige oplossing: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 (watervrij), 0,24 g KH 2 PO 4, 1 ml Tween-20. Pas de pH van de oplossing tot 7,4 en vul tot 1,0 L.
1X overdracht buffer gedurende 1 L waterige oplossing: 3,0 g Tris base, 14,4 g glycine, 150 ml methanol.
1X SDS-PAGE lopende buffer gedurende 1 L waterige oplossing: 3,0 g Tris base, 14,4 g glycine, 1,0 g SDS.
SDS-PAGE-monsterbuffer vermindering van 10 ml oplossing: 0,6 g SDS, 3 ml glycerol, 1,8 ml 1,0 Tris-HCl pH 6,8, 1 mg broomfenolblauw, 5% (v / v) 2-mercaptoethanol.
- Groei HEK 293T cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) foetaal bovine serum (FBS), 1X pen / strep bij 37 ° C in een 5% CO2-vochtige atmosfeer.
- Let op cellen onder een omgekeerde microscoop. Wanneer de cellen zijn op 100% confluentie, te verwijderen en weggooien kweekmedium.
- Spoel cellen met 5 ml steriel 1X PBS om sporen van het serum te verwijderen. Gooi de PBS wassen.
- Voeg 2 ml 0,05% (w / v) trypsine-EDTA oplossing voor een T225 cm2 fles (1 ml of 0,05% (w / v) trypsine-EDTA voor T75 cm2 fles) en incuberen bij kamertemperatuur totdat cellen los van het oppervlak. Het is ook mogelijk om steriel 1X PBS-EDTA gebruiken HEK 293T cellen los.
- Voeg 13 ml DMEM met 10% (v / v) FBS een T225 cm2 fles (of 9 ml DMEM met 10% (v / v) FBS voor T75 cm2 fles) de trypsine reactie te remmen.
- Split cel 1:5. Voor T225 cm2 fles, 3 ml celsuspensie 27 ml vers DMEM met 1X pen / strep en 10% (v / v) FBS in een nieuwe kweekvat. Voor een T75 cm2 fles, 2 ml celsuspensie 8 ml vers kweekmedium. Incubeer culturen bij 37 ° C in een 5% CO2-vochtige atmosfeer. De cellen moeten groeien naar 100% confluentie binnen twee dagen.
Box 2. Western blot analyse
- Voeg 10 ul SDS-PAGE het verminderen van monsterbuffer tot 30 ul celkweeksupernatant. Plaats monsters en prestained molecuulgewichtsmerkers op polyacrylamide gels en electrophorese met 1X SDS-PAGE lopende buffer van 175 V gedurende 1 uur tot molecuulgewichtsmerkers goed opgelost.
- Laat de PVDF Immobilon-P membraan 100% methanol gedurende 1 minuut te activeren.
- Monteren western blot inrichting. Zorg ervoor dat de PVDF-membraan wordt geconfronteerd met de positieve elektrode en houden alle onderdelen nat met 1X overdracht buffer. Avoid luchtbellen tussen de polyacrylamidegel en het membraan.
- Volledig vullen van de kamer met elektroforese 1X transferbuffer en overdracht gedurende 1 uur bij 100 V.
- Blok het membraan met 5% (w / v) magere melk in PBS-1X Tween20 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Incuberen met monoklonale primaire antilichaam (bijvoorbeeld 1:1000 anti-HA mAb of een ander geschikt antilichaam), opgelost in 5% (w / v) afgeroomde melk in PBS-1X Tween20 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Was de membranen in 1X PBS-Tween20 gedurende 10 minuten. Herhaal dit twee extra keer.
- Incuberen met een monoklonaal secundaire antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase (1:1000 verdunning in 5% (w / v) afgeroomde melk in PBS-1X Tween20) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Was de membranen in 1X PBS-Tween20 gedurende 10 minuten. Herhaal dit twee extra keer.
- Plaats het membraan in een kleine container, voeg 5 ml alkalische fosfatase Hydrote (BVIE / NBT) oplossing. Kleur ontwikkeling moet plaatsvinden binnen 1-5 minuten. Zodra de gewenste band intensiteit is bereikt, wassen met gedemineraliseerd water en de lucht drogen. Kleur kan na verloop van tijd; elektronisch scannen van de membranen een keer droog.
Box 3. Reiniging en recycling van celkweek schepen
Terwijl de cel als fabriek zijn ontworpen om eenmalig gebruik zijn, kunnen deze schepen worden gerecycled voor extra grootschalige transfecties met de volgende schoonmaak protocol:
- Onmiddellijk na decanteren het supernatans van de 10 laag cel fabriek van 20% (v / v) bleken en schud de cellen los. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende drie uren.
- Leeg het vaartuig en voeg verse 20% (v / v) bleken en incuberen bij kamertemperatuur.
- Leeg het schip en was met 1,5 liter gedeïoniseerd water. Herhaal dit drie keer.
- Leeg de 10-laag cel als fabriek en 0,5 L van steriele 1X PBS aangevuld met 10X antibiotica / Antimycoticum oplossing. Sla het vat bij kamertemperatuur en vervangen ontluchting caps vulopeningen (standaard 33 mm schroefdraad hoofdletters) voor het volgende gebruik. Let op: alle lagen moet volledig duidelijk zijn na het reinigen, zo niet, gebruik dan niet de cel als fabriek beschikken volgens de institutionele richtlijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 10 lagen celfabrieken een effectieve vat voor de productie van milligram hoeveelheden eiwit. Een belangrijk voordeel van de cel fabriek op andere traditionele vaartuigen zoals rolflessen, schudkolven of spinner kolven, is dat niet nodig de aanschaf van extra laboratoriumapparatuur. Een standaard CO 2 incubator (~ 6,0 cu. Ft) zal gemakkelijk geschikt voor vier 10-layer cel als fabriek (afb. 2). Bovendien vereisen deze vaartuigen minder arbeid en ruimte dan schotels of rolflessen van cellen en eiwitten, een 10 laag celfabriek is gelijk aan het gebruik van 7,5 regelmatige rolflessen (Tabel 1). Belangrijker is dat de HEK 293T-cellen aan te passen goed in de schepen en zijn zeer vatbaar voor transiënte transfectie van PEI, en zo een goedkope en effectieve optie om commerciële transfectie reagentia. Terwijl de cel als fabriek zijn ontworpen om eenmalig celkweek plasticware zijn, hebben we bEEN-in staat om efficiënt te reinigen en opnieuw gebruiken van deze schepen meerdere malen zonder besmetting problemen, dus een aanzienlijke vermindering van de kosten per gebruik. Transiënte eiwitexpressie met een 10 laag celfabriek kan produceren ~ 1-10 mg gezuiverd eiwit (Fig. 4), afhankelijk van het eiwit en wijzigingen. Het is mogelijk om van klonen en kleine expressie voltooid grootschalige expressie en zuivering van 3-4 weken. Samenvattend is een algemene en snelle platform dat zeer nuttig bij de productie van uitgescheiden menselijke of virale manteleiwitten. Bovendien kan dit platform ook worden gebruikt om antilichamen virusachtige deeltjes en adenovirussen en lentivirussen voor genoverdracht drukken.
Hieronder hebben wij voor veel voorkomende problemen en mogelijke oplossingen. Voor een meer gedetailleerde handleiding Problemen oplossen, zie 14.
- Geen of zeer laag eiwit expressie:
- Slechte hEZONDHEID van de cellen-vlekken op de cellen met behulp van trypanblauw voor levensvatbaarheid en test voor mycoplasma besmetting. Als cellen hebben een hoge passage aantal (> 25 passages) en worden langzaam groeiende, een frisse start met nieuwe HEK 293T-cellen. Transfectie-efficiëntie en eiwitproductie worden beïnvloed door de leeftijd van de cellen in kweek.
- Slechte transiënte transfectie-cellen moeten worden getransfecteerd met een confluentie van 40%. De verhoudingen van DNA transfectie reagentia worden geoptimaliseerd.
- Eiwit is niet stabiel of de celpellet gevouwen Check voor onoplosbaar eiwit. Test de expressie van andere constructen of homologe eiwitten.
- Geen eiwitten wordt geëlueerd uit kolom:
- Eiwit op de kolom-elueren het eiwit van interesse met 0,1 M glycine pH 2,2 en geanalyseerd door Western blot. Als eiwit wordt vastgehouden, gebruik een hogere concentratie kunststof HA peptide voor elutie of incuberen de kolom bij 37 ° C voor langere perioden.
- anti-HA-Column beschadigd-Terwijl de kolom wordt gereinigd en goed bewaard worden hergebruikt meerdere malen wordt de efficiëntie van de kolom na verloop van tijd. Gebruik een nieuwe anti-HA-kolom.
- Eiwit degradatie-Voeg proteaseremmers en blijf eiwit op ijs gedurende het gehele zuiveringsproces.
- Eiwit heeft neergeslagen of geaggregeerd op kolom-Als het eiwit niet stabiel is, probeer dan verschillende constructen of buffer omstandigheden (bijv. pH, zouten, additieven, enz.) aan eiwit stabiliteit te verbeteren.
- Eiwit niet te binden aan kolom-De HA-tag kan worden begraven of ontoegankelijk. Controleer de eiwit niet in de stroom doorheen te wassen.
- Serum albumine besmetting:
Bovine serum albumine (BSA) meestal niet-specifiek binden aan de anti-HA hars en kan verontreinigen HA peptide eluties. In Fig. 4 BSA migreert een compact band op een schijnbaar molecuulgewicht van 60 tot 65 kDa ~. In dit geval verhogen Tween-20 concentratie in de 1X PBS-Tween20 wassen tot 0,2% (v / v) en het volume van de was. Ook kan BSA verontreiniging verwijderd worden met size exclusion of ionenuitwisselingschromatografie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Ontario HIV Treatment Network Research Operating Grant (ROG-G645) en Canadese Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) om JEL, en de Universiteit van Toronto beurzen naar HA, FCA, en JDC. De auteurs willen graag Marnie Fusco, Dafna Abelson en dr. Erica Ollmann Saphire danken aan het Scripps Research Institute (La Jolla, CA) voor het leveren van cellen, ebolavirus GP expressievector en algemeen advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
| Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
| Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
| Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
| Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
| Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
| Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
| Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
| Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
| Chromatography glass column, 1.0x10 cm | Kontes | 4204001010 | |
| Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
| CO2 | |||
| Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
| Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
| FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
| GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
| phosphatase-conjugated antibody | |||
| Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
| (sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
| MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
| MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
| NaN3 | Sigma | S8032 | |
| pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
| Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
| Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
| Skim milk dry powder | Carnation | ||
| Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
| 0.22 μm, 500 ml capacity | |||
| Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| Valproic acid | Sigma | P4543 | |
| Centramate tangential flow system | Pall | ||
| CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
| Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
| Incubator, 37 °C | various brands are available |
References
- Celik, E., Calik, P. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Yokoyama, S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol. Adv. , (2011).
- Lee, J. E. Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor. Nature. 454, 177-182 (2008).
- Bowden, T. A. Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).
- Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells. J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).
- Ye, J. High-level protein expression in scalable CHO transient transfection. Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP. Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).
- Aricescu, A. R. Eukaryotic expression: developments for structural proteomics. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).
- Chang, V. T. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).
- Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells. Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).
- Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu. Nature. 451, 425-430 (2008).
- Nakamura, Y. Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling. Nature. 369, 330-333 (1994).
- Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors. Science. 310, 1159-1163 (2005).
