Plaque-Assay für Murine Norovirus

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um infektiöse Partikel von murinem Norovirus (MNV), die die einzige Norovirus die effizient repliziert in Zellkultur ist quantifizieren. Die Plaque-Assay nutzt MNV den Tropismus für murinen Makrophagen und können zur Verwendung mit biologischen oder Umweltproben enthaltenden MNV angepasst werden.

Abstract

Murine Norovirus (MNV) ist das einzige Mitglied des Norovirus Gattung, die effizient wächst in Gewebekultur ^{1, 2.} Zelllyse und cytopathischen Effekt (CPE) während MNV-1-Infektion von murinem dendritische Zellen oder Makrophagen ¹ beobachtet. Diese Eigenschaft der MNV-1 kann verwendet werden, um die Anzahl der infektiösen Partikel in einer bestimmten Probe durch Durchführen einer Plaque-Assay ¹ zu quantifizieren. Die Plaque-Assay beruht auf der Fähigkeit von MNV-1 an Zellen zu lysieren und die Löcher in einer konfluenten Zellmonolayer, die aufgerufen werden ³ Plaques bilden.

Mehrere Techniken können verwendet werden, um virale Infektionen in Gewebekultur, geerntet Gewebe, klinischen und Umweltproben nachzuweisen, aber nicht alle Maßnahme die Zahl der infektiösen Partikel (zB qRT-PCR). Ein Weg, um infektiöse virale Partikel zu quantifizieren ist, um eine Plaque-Assay ^3, welche im Detail unten beschrieben wird ausgeführt. Eine Variation des MNV Plaque-Assay ist die fluorescent Fokus Assay, wobei MNV Antigen in Zellmonoschichten ⁴ immungefärbt wird. Dieser Assay kann schneller sein, da virale Antigen-Expression vorausgeht Plaquebildung. Es ist auch nützlich zum Titrieren Viren nicht in der Lage, Plaques zu bilden. Jedoch erfordert das fluoreszierende Fokus Assay zusätzliche Ressourcen über die des Plaque-Assay, wie Antikörper und einem Mikroskop, um Fokus-bildenden Einheiten zu zählen. Infektiöse MNV kann auch durch Bestimmung der 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID ₅₀₎ ³ quantifiziert werden. Dieser Assay misst die Menge des Virus erforderlich ist, um CPE in 50% der Gewebekulturzellen inokuliert durch Titrationsverdünnung ⁵ herzustellen. Allerdings ist seine Nachweisgrenze höher im Vergleich zu einem Plaque-Assay ^4.

In diesem Artikel beschreiben wir einen Plaque-Assay-Protokoll, das verwendet wird, um effektiv die Anzahl von infektiösen MNV vorhandenen Partikel in biologischen oder Umweltproben ^{1, 4, 6} kann. Diese Methode ist based auf die Herstellung von 10-fache serielle Verdünnungen von MNV-haltigen Proben, die verwendet werden, um eine Monoschicht von permissiven Zellen (murine Makrophagen RAW 264.7-Zellen) zu inokulieren werden. Virus läßt auf die Zellmonoschicht für einen gegebenen Zeitraum befestigen und dann abgesaugt vor dem Abdecken Zellen mit einem Gemisch von Agarose und Zellkulturmedien. Der Agar ermöglicht die Ausbreitung von viralen Nachkommen zu benachbarten Zellen bei gleichzeitiger Begrenzung Ausbreitung auf weit entfernten Zellen. Folglich werden infizierten Zellen lysiert und Form Löcher in der Monoschicht als Plaques bekannt. Bei ausreichender Ausbreitung des Virus, Plaques sichtbar geworden folgenden Färbung der Zellen mit Farbstoffen, wie Neutralrot, Methylenblau, Kristallviolett oder. Bei niedrigen Verdünnungen, stammt jedes Plaque von einem infektiösen Viruspartikel und seiner Nachkommen, die auf benachbarte Zellen ausbreiten. Somit Zählen der Anzahl der Plaques erlaubt es, Plaque-bildenden Einheiten (PFU) in der unverdünnten Probe ^{3 zu} berechnen.

Protocol

Ein. Kultivierung der Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 Pflegen RAW 264.7-Zellen (ATCC, Katalog # TIB-71) in DMEM-10 Medien, die von hoher Glucose DMEM besteht mit 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (<10 eu > Hinweis: Es ist ratsam, mehrere Flaschen mit autoklavierten SeaPlaque Agarose vorbereitet haben vor der Zeit. Agarose kann in einer Mikrowelle vor Gebrauch wieder aufgeschmolzen werden. Den Gehalt an Überlagerung für das Gesamtvolumen der Platten erforderlich, bevor die Inkubation 1 Stunde beendet ist. Das Volumen benötigt wird, 2 ml / well oder 12 ml/6-well Platte. Bereiten Agarose (siehe Abschnitt 3.2) und Medien (siehe Abschnitt 3.3) getrennt. Um die Agarose vorzubereiten, auszusetzen 3 g SeaPlaque Agarose in einem Gesamtvolumen von 100 ml destilliertem Wasser (3% w / v) in einer Glasflasche. Autoklaven für 20-30 min. (Wenn Agarose wurde bereits vor Hand, re-melt Agarose in der Mikrowelle zubereitet.) Es ist wichtig, SeaPlaque Agarose auf 42 ° C im Wasserbad vor Gebrauch, denn wenn die Agarose zu heiß ist, wird es die Zellen zu töten äquilibrieren. Stellen Sie sicher Wasserstand ist gleich oder höher als das Niveau der Agarose zu unerwünschten Verfestigung zu vermeiden. Um die Medien vorzubereiten: make 100 ml 2x MEM-Medium, das sich aus2x MEM, 10% (v / v) endotoxinarmes fötalem Rinderserum (<10 eu >

Discussion

Die Plaque Assay-Verfahren für MNV-1 dargestellt ist hier ein Weg zur Quantifizierung infektiösen MNV Teilchen. Durch Befolgen der Schritte Assay in 3 dargestellt, kann man erhalten reproduzierbare viralen Titern. Die Nachweisgrenze des Tests hängt von der ausgehend Verdünnung verwendet. Beim Starten mit einer 1:10 Verdünnung der Probe, wie oben beschrieben, ist die Nachweisgrenze des Plaque-Assay 10 pfu (dh 1 Plaque sichtbar am 10 ^{-1-Verdünnung).} Da jeder Plaque stellt einen einzigen Virus, kann die Plaque-Assay auch zur klonalen Populationen von MNV durch Abheben isolierte Plaques und Propagieren sie wie zuvor beschrieben ¹ zu reinigen. Zusätzlich kann Plaqueaufreinigungen auch verwendet, um eine einzelne Viruspopulation aus gemischten Viruspopulationen abzutrennen. Eine Beschränkung der Verwendung eines Plaque-Assay zum Nachweis von MNV Infektion ist, dass nicht alle Stämme MNV Plaques bilden ^4. Jedoch kann es möglich sein, die überwunden inability einiger MNV-Stämme, die von Tieren isoliert, um Plaques durch serielles Passagieren diese Viren in Gewebekultur ⁷ bilden. Eine Alternative zu dem Plaque-Assay ist, um infektiöse Partikel über die TCID _50-Technik ^{3, 4} zu messen. Dieser Assay quantifiziert die Menge des Virus benötigt, um CPE in 50% der inokulierten Gewebekulturzellen nach Endpunkt Verdünnungen und dauert 1 Woche für MNV ⁴ abzuschließen produzieren. Zusätzlich dazu, dass langsamer als ein Plaque-Assay ist die TCID _50-Test auch nicht so empfindlich (Nachweisgrenze = 200 TCID ₅₀ / ml) auf Grund der Toxizität von Gewebeproben zu RAW 264.7 Zellen ^4.

Obwohl kritischen Schritte im Protokoll über das Protokoll beschrieben wurden, bietet der folgende Abschnitt eine Zusammenfassung zur Fehlersuche zu erleichtern. Der wichtigste Schritt in der Protokoll stellt sicher, dass RAW 264.7 Zellen lebensfähig bleiben während des Assays zur Virusreplikation unterstützen. Dies kannin jeder Stufe des Assays über Lichtmikroskopie beobachtet werden. Zelllebensfähigkeit wird auf zweierlei Weise gewährleistet. Erstens sollte darauf geachtet werden, nicht zu lassen Zellen austrocknen beim Umgang Platten werden. Somit werden die Platten einzeln inokuliert geschaukelt während der Infektion Periode und zu schließen, wenn sie nicht behandelt werden, bleiben. Zweitens Lösungen auf Zellen gegeben sein sollte äquilibriert ~ 37 ° C. Weiterhin ist es von entscheidender Bedeutung für die Gesundheit der RAW 264.7-Zellen, um sie in Medien, die Serum endotoxinarm (<10 EU / ml), die Aktivierung von Zellen begrenzt zu halten. Darüber hinaus haben wir einen höheren Ausfallrate der Plaque-Assay unter Verwendung von Zellen beobachtet, wenn von dem Durchgang 30 oder höher. Obwohl dies wird wahrscheinlich von Labor zu Labor unterschiedlich ist, ist es wichtig, eine positive Kontrolle gehören (zB eine Probe mit einem bekannten viralen Titer), um reproduzierbare Titer zu gewährleisten, vor allem bei höheren Durchgang RAW 264,7 Zellen. Um die Verwendung von höheren Durchgang Zellen zu begrenzen, ist es ratsam, Fläschchen frühen passa einfrierenge-Zellen nach Erhalt der RAW 264,7 Zellen und starten Sie eine neue Kultur aus den gefrorenen Flaschen häufig. Starting over mit niedrigen Durchgang Zellkulturen wird auch hilfreich sein, wenn die Zellen veränderte Eigenschaften, wie Fehler zu haften, Veränderungen in der Zellmorphologie (zB von Runde zu spindly und ausbreiten), oder wenn Mykoplasmen-Kontaminationen festgestellt wurde ausstellen. Ein weiterer wichtiger Punkt, um die Aufmerksamkeit zu zahlen, ist zu gewährleisten, dass Pipettenspitzen zwischen den Proben und während Verdünnungen geändert werden. Dadurch wird sichergestellt, genaue Verdünnungsreihen und verhindern eine Kreuzkontamination zwischen den Proben. Derjenige Schritt im Protokoll wo dieselbe Pipettenspitze wieder verwendet werden kann, wenn serielle Verdünnungen der gleichen Probe zu den Vertiefungen zugegeben. In diesem Fall, sollte man von den meisten verdünnten Inokulum für die am wenigsten zu starten, und kräftig und Abpipettieren bei der Ausarbeitung eines neuen Verdünnung.

Die Plaque-Assay-Protokoll ist änderbare mehrere Modifikationen. Eine Änderung, die vorgenommen, wenn t werdenhier sind nicht genügend Zellen zum Impfen Vertiefungen in zweifacher Ausfertigung ist, lediglich einen einzigen Bohrung für jede Verdünnung zu inokulieren. Da jedoch das Inokulum Volumen 0,5 ml, die Zahl der Plaques muss dann um einen Faktor von 2 bis zu pfu / ml normalisieren multipliziert. Die Plaque-Assay kann auch für den Einsatz mit jedem anderen adhärenten Zelllinie, die die Replikation von MNV unterstützen angepasst werden, und dies hat für die murine Mikroglia BV-2-Zelllinie ⁸ beschrieben worden. Andere Modifikationen, die implementiert werden können, sind Anpassungen, die für Plaque-Assay-Protokolle für andere Viren entwickelt beschrieben wurden. Im Falle von MNV, haben die folgenden Änderungen bereits erfolgreich umgesetzt; die Verwendung von Methylzellulose statt Sea Plaque Agarose ⁹ und Färbung der Zellen mit Kristallviolett oder Methylenblau anstelle von Neutralrot ^{10, 11.}

Insgesamt kann dieses Protokoll leicht angepasst je nach Bedarf auf andere Plaque-bildenden Viren zu quantifizieren oder für oth werdener Viren, die lytische Infektionen in RAW 264,7 Zellen verursachen, so dass es ein nützliches Werkzeug, um infektiöse Viruspartikel in der Regel quantifizieren.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC