손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석
Summary
여기 효율적으로 세포 배양에 복제 유일한 노로 바이러스입니다 손쥐 노로 바이러스 (MNV)의 전염성 입자를 정량화하는 방법을 설명합니다. 플라크 분석은 손쥐 대 식세포에 대한 MNV의 tropism을 활용하고 MNV를 포함하는 생물이나 환경 샘플에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.
Abstract
손쥐 노로 바이러스 (MNV)는 효율적으로 조직 배양 1, 2에서 자랍니다 노로 바이러스의 종류의 유일한 회원입니다. 세포 용해 및 cytopathic 효과 (CPE) 손쥐 수지상 세포 나 대 식세포 1 MNV-1 감염 동안 관찰합니다. MNV-1이 속성은 상패 분석 1 수행하여 주어진 예제에서 전염성 입자의 수를 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. 플라크 분석은 세포를 lyse하고 액자 3이라고 합류 셀 monolayer에 구멍을 형성 MNV-1의 능력에 의존합니다.
여러 개의 기술은 조직 배양, 수확 조직, 임상, 환경 샘플에서 바이러스 감염을 감지하는 데 사용하지만, 모든 측정 전염성 입자의 수 (예 : qRT-PCR). 할 수 있습니다 전염성 바이러스 입자를 수량화 할 수있는 방법 중 하나는 아래에 상세하게 설명 될 것이다 상패 분석 3을 수행하는 것입니다. MNV 플라크 분석에 변형 형석입니다MNV 항원이 세포 monolayers 4 immunostained되어 escent 초점을 분석. 바이러스 항원 표현이 플라크 형성을 앞에 때문에이 분석은 빠르게 할 수 있습니다. 또한 액자를 형성 할 수없는 바이러스를 titrating하는 데 유용합니다. 그러나, 형광 초점 분석은 항체과 집중 – 성형 단위를 계산하는 현미경으로 상패 분석의 이외의 추가 리소스를 필요로합니다. 전염성 MNV도 50 % 조직 문화 Infective 선량 (TCID 50) 3 결정하여 정량화 할 수 있습니다. 이 분석은 엔드 포인트 적정 (5)에 의해 주사 조직 배양 세포의 50 %에 CPE를 생산하는 데 필요한 바이러스의 양을 측정합니다. 그러나, 감지의 제한이 상패 분석 (4)에 비해 높다.
이 문서에서는, 우리는 효과적으로 생물학적 또는 환경 샘플 1, 4, 6 제시 전염성 MNV 입자의 수를 결정하는 데 사용할 수있는 상패 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 바 있습니다허용 세포 (RAW 264.7 대 식세포 손쥐 세포)의 monolayer의 예방하기 위해 사용됩니다 MNV 함유 샘플의 10 배 시리얼 dilutions의 준비에 SED. 바이러스는 주어진 기간 동안 세포 monolayer에 연결하도록 허용하고 아가로 오스와 세포 배양 매체의 혼합과 셀을 포함하기 전에 흡입합니다. 먼에 위치한 셀에 확산을 제한하는 동안 한천은 주변 세포에 바이러스 자손의 확산을 수 있습니다. 따라서, 감염된 세포 lysed과 monolayer에서 양식 구멍 액자로 알려져 있습니다. 바이러스의 충분한 보급되면, 액자는 중립적 인 빨강, 메틸렌 블루, 또는 크리스탈 바이올렛과 같은 염료와 셀의 표시 다음 착색된다. 낮은 dilutions에서 각 상패는 이웃 세포로 확산 한 전염성 바이러스 입자와 자손에서 유래 된 것입니다. 따라서, 액자의 수를 계산하는 것은 하나가 undiluted 샘플 3 현재 상패 – 성형 단위 (PFU)를 계산 할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시된 MNV-1에 대한 상패 분석 방법은 전염성 MNV 입자를 정량화하는 방법이다. 그림 3에 도시 된 검정 단계를 수행하여 하나는 재현 바이러스 titers를 얻을 수 있습니다. 분석의 검출의 제한은 사용 시작 희석에 따라 달라집니다. 위의 설명에 따라 샘플의 1시 10분 희석로 시작하면, 상패 분석의 검출 한계는 10 PFU (즉, 10 -1 희석에 표시 한 명판)입니다. 각 플라크가 하나의 바이러스를 대표하기 때문에, 상패 분석은 절연 액자를 선택하고 그들에게 이전 한 기술 전파에 의해 MNV의 clonal 인구를 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 상패의 purifications는 혼합 바이러스 집단에서 개별 바이러스 인구를 구분하는 데 사용할 수 있습니다. MNV 감염의 검출을위한 상패 분석을 사용의 한계는 모든 MNV의 변종이 액자 4 대를 형성한다는 것입니다. 그러나, inabili을 극복 할 수도 있습니다직렬 조직 배양 7이 바이러스를 passaging하여 액자를 형성하는 동물로부터 분리 일부 MNV의 변종의 타이. 상패 분석에 대한 대안은 TCID 50 기술 3, 4를 통해 전염성 입자를 측정하는 것입니다. 이 분석은 엔드 포인트 dilutions와 MNV 4 완료 일주 소요에 따라 주사 조직 배양 세포의 50 %에 CPE를 생산하는 데 필요한 바이러스의 양을 단정 지을. 상패 분석보다 느린 것뿐만 아니라, TCID 50 검정는 또한 문자를 구분하지 않습니다 (감지 한계 = 200 TCID 50 / ML) RAW 264.7 세포 4 조직 샘플의 독성으로 인해.
프로토콜에서 중요한 단계 프로토콜을 통해 설명되어 있지만, 다음 절 문제 해결을 촉진 할 수있는 요약을 제공합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 RAW 264.7 세포가 바이러스 복제를 지원하는 분석을 통해 가능한 상태로 유지하는 것입니다. 이 수빛 현미경을 통해 분석의 각 단계에서 모니터링 할 수. 세포 생존 능력은 두 가지 방법으로 보장되어 있습니다. 첫째, 치료가 접시를 처리하는 동안 셀 아웃 리곤하지 않도록해야합니다. 따라서, 접시는 한 번에 하나씩 주사 감염 기간 동안 뻔하며, 처리되지 않습니다 때마다 유지 폐쇄해야합니다. 둘째, 솔루션은 세포에 추가하면 ~ 37 ° C.에 equilibrated해야 또한, 세포의 활성화를 제한하는 낮은 독소 혈청 (<10 EU / ML)가 포함 된 미디어를 유지하는 RAW 264.7 세포의 전반적인 건강에 중요합니다. 통로 30 이상 세포를 사용하는 경우 또한, 우리는 상패 분석의 높은 실패율을 관찰했습니다. 이 가능성이 실험실에서 실험실에 따라 다를 수 있지만, 더 높은 통로 RAW 264.7 세포를 사용하여 특히, 재현 titers을 보장하기 위해 (예를 들어, 알려진 바이러스 titer와 샘플) 긍정적 인 제어를 포함하는 것이 중요합니다. 높은 통로 세포의 사용을 제한하기 위해, 일찍 무슨 일이야? 병을 고정 할 것이 좋습니다RAW 264.7 세포의 수령과 자주 얼어 붙은 병에서 새로운 문화가 시작시 GE 세포. 셀 변경 등, 세포 형태의 변화를 준수 (예 : 원형에서 가늘고 긴과 분산)를 위해 실패와 같은 특성, 또는 mycoplasma 오염이 감지되었습니다 전시 때 낮은 통로 세포 문화와 다시 시작하면 도움이 될 것입니다. 에주의를 지불 할 또 다른 중요한 점은 피펫 팁이 샘플 사이의 dilutions 동안 변경되어 있는지 확인하는 것입니다. 이 정확한 시리얼 dilutions을 보장 함과 샘플 사이의 교차 오염을 방지 할 수 있습니다. 동일한 샘플의 시리얼 dilutions가 우물에 추가 할 때 같은 피펫 팁을 다시 사용할 수있는 프로토콜의 한 단계입니다. 이 경우, 하나는 가장 희석 inoculum에서 최소로 시작하고 새로운 희석을 그릴 때 힘차게 아래로 피펫과해야합니다.
상패 분석 프로토콜은 몇 가지 수정으로 수정할 수있는 것입니다. t 변경 할 수있는 하나 수정여기에 중복에 우물을 inoculating 충분한 세포가 아닌 각 희석 만 한 우물을 예방하는 것입니다. inoculum 볼륨이 0.5 ML이기 때문에 그러나, 액자의 수는 PFU / ML에 정상화하기 위해 2 인자를 곱한해야합니다. 상패 분석도 MNV의 복제를 지원 할 수 있습니다 다른 자기편 세포 라인에 사용하기 위해 구성 될 수 있으며, 이것은 손쥐 microglial BV-2 세포주 8 설명되어 있습니다. 구현 될 수있는 다른 수정은 다른 바이러스 개발 상패 분석 프로토콜에 대해 설명 된 적응합니다. MNV의 경우, 다음과 같은 수정은 이미 성공적으로 구현 된, 메틸 대신 바다 플라크의 셀룰로오스 아가로 오스 9, 크리스탈 바이올렛 또는 그 대신 중립적 인 빨간색 10, 11의 푸른 메틸렌과 세포의 착색의 사용.
기타 상패 – 성형 바이러스를 수량화하기 위해 필요한 또는 oth에 사용으로 전반적으로,이 프로토콜을 쉽게 적용 할 수 있습니다그 일반적으로 전염성 바이러스 입자를 수량화 할 수있는 유용한 도구 만들기, RAW 264.7 세포에서 lytic 감염을 일으킬 응급실 바이러스.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 중요한 의견과 제안을위한 Wobus 연구소의 회원 감사드립니다. CEW의 실험실에서 일이 미시간 대학, 바이오 방어를위한 우수의 NIH / NIAID 지역 센터와 신흥 전염병 연구 (경찰과) 프로그램, 지역 V '위대한에서 경력 개발 기금에서 시작 – 자금에 의해 추진하는 사업 호수 '경찰과 (NIH 상 1-U54-AI-057153)와 NIH R01 AI080611. MBG-H. 미시간 대학에 실험 면역학 (NIH T32 A1007413-16)와 미생물 Pathogenesis에있는 분자 메커니즘 (NIH T32 A1007528) 교육 교부금의 지원을받는되었다. JBC는 Coordenação 드 Aperfeiçoamento 드 Pessoal 드 Nível 수 페리 어 (망토), 브라질리아, 브라질의 지원을받는되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
| 2x MEM | Gibco | 11935 |
| 100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
| 10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
| 200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
| Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
| Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
| 1x PBS | Gibco | 10010 |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
| Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
| Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
| Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |
References
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