Mürin Norovirüs için Plak Testi
Summary
Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.
Abstract
Mürin norovirusa (MNV) verimli doku kültürü 1, 2 yetişir Norovirüs cinsinin tek üyesidir. Hücre parçalama ve sitopatik etki (CPE) fare dendritik hücreler veya makrofajlar 1 MNV-1 enfeksiyonu sırasında görülür. MNV-1 Bu özellik, bir plak deneyi 1 gerçekleştirerek, belirli bir örnek içinde bulaşıcı maddelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Plak tahlil olmuş akyuvarlar ve plaklar 3 olarak adlandırılan bir birleşik hücre monolayer, delik oluşturmak için MNV-1 yatmaktadır.
Birden çok doku kültürü teknikleri, hasat edilmiş doku, klinik, çevre örneklerde viral enfeksiyonların tespit etmek için kullanılır, fakat hepsi değil ölçü bulaşıcı parçacıklar (örn. qRT-PCR). Edilebilir Bulaşıcı virüs parçacıkları ölçmek için bir yolu, aşağıda daha detaylı olarak tarif edilecektir bir plak deneyi 3, gerçekleştirilmesidir. MNV plak tahlil bir varyasyonu flor olduğunuMNV antijen hücre mono tabakaları 4 immunohistokimyasal edilir escent odak tahlil. Viral antijen ekspresyonu plak oluşumu önündeki tarihi Bu testte, daha hızlı olabilir. Aynı zamanda, plak oluşturan yapamaz virüs titrasyonu için yararlıdır. Ancak, floresan odak tahlil gibi antikorlar ve odak oluşturan birim saymak için bir mikroskop gibi plak testin ötesinde ek kaynaklar gerektirir. Bulaşıcı MNV ayrıca% 50 Doku Kültürü Enfektif Doz (TCID 50) 3 belirlenerek ölçülebilir. Bu tahlil, uç 5 ile titrasyon aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarını ölçer. Ancak, algılama sınırına bir plak tahlil 4 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir.
Bu yazıda, etkili biyolojik ya da çevresel numuneler 1, 4, 6 mevcut bulaşıcı MNV parçacıkların sayısını belirlemek için kullanılabilecek bir plak tahlil protokol açıklar. Bu yöntem olup baizin veren hücreler (RAW 264.7 mürin makrofaj hücreleri) bir tek tabaka aşılamak için kullanılır MNV ihtiva eden numuneler, 10-kat seri seyreltiler hazırlanması sed. Virüs zaman belirli bir süre için hücre mono tabakasında bağlanmasına izin verilir ve daha sonra agaroz ve hücre kültür ortamı bir karışımı hücreleri kapsayan önce aspire edilir. Soğuk bir şekilde yer alan hücrelere yaymak sınırlandırarak agar komşu hücreler, viral soy yayılmasını sağlar. Sonuç olarak, enfekte olmuş hücreler lize ve mono tabakasında deliklerin şekil plaklar olarak bilinir. Virüsün yeterli yayılması üzerine, plaklar nötr kırmızı, metilen mavisi veya kristal viyole gibi boyalar ile hücrelerin görünür aşağıdaki boyama olur. Düşük dilüsyonları, her plak komşu hücrelere yayılmış tek bir bulaşıcı viral partikül ve döl, kaynaklanır. Böylece, plakların sayısını sayma biri seyreltilmemiş numune 3 mevcut plak oluşturan birim (PFU) hesaplamak için izin verir.
Protocol
Discussion
Burada sunulan MNV-1 için plak metodu bulaşıcı MNV parçacıkların miktarının bir yoludur. Şekil 3'de gösterilen tahlil adımı takip ederek, tekrar üretilebilir bir viral titreler elde edebilir. Testin tespit limiti kullanılan başlangıç seyreltme bağlıdır. Yukarıda açıklandığı gibi örnek bir 1:10 seyreltme ile başlarken, plak testin saptama sınırının 10 pfu (yani, 10 -1 seyreltme görülebilir 1 plak) 'dir. Her bir plak tek bir virüs temsil ettiği için, plak deneyi, izole plaklar çekme ve bunları daha önce tarif 1 yayarak MNV klonal popülasyonları saflaştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, plak saflandırma da karışık virüs popülasyonlarının tek başına bir virüs popülasyonunun ayırmak için de kullanılabilir. MNV enfeksiyonun tespiti için bir plak tahlil kullanarak bir sınırlaması tüm MNV suşların plaklar 4 oluştururlar olmasıdır. Bununla birlikte, inabili üstesinden gelmek mümkündürseri doku kültürü 7 bu virüsler pasajlanmasını tarafından plak oluşturan hayvanlardan izole edilen bazı suşları MNV, ve ty. Plak tahlil alternatif TCID 50 tekniği 3, 4 ile bulaşıcı partikülleri ölçmektir. Bu tahlil, uç nokta seyreltmeleri ile MNV 4-tamamlanması 1 hafta sürer aşağıdaki aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarı miktarını belirler. Bir plak deneyi daha yavaş olmasına ek olarak, TCID 50 tahlil ayrıca şu şekilde duyarlı değildir (tespit limiti = 200 TCID 50 / ml), RAW 264.7 hücreleri, 4 doku örneklerinin toksisite nedeniyle.
Protokolü içerisindeki kritik adımlar protokol boyunca tarif edilmiş olmasına rağmen, aşağıdaki bölümde sorun giderme kolaylaştırmak için bir özet sunar. Protokolde en kritik adım RAW 264.7 hücreleri virüs çoğaltması desteklemek için test boyunca canlı kalmasını sağlamaktır. Bu canışık mikroskobu ile testin her aşamasında izlenecektir. Hücre canlılığı, iki yolla sağlanır. Birincisi, bakım plakaları tutarken hücrelerin kurumasına izin vermeyin alınmalıdır. Böylece, plakaları, bir defada bir aşılanmış enfeksiyon döneminde sarsan ve onlar ele edilmemesi zaman kalır kapalı olmalıdır edilmektedir. İkinci olarak, çözeltiler hücrelerin üzerine ilave ~ 37 ° C 'ye dengelenmiş olmalıdır Bundan başka, hücrelerin aktivasyonu sınırlayan düşük endotoksin serum (<10 EU / ml) içeren ortam içinde bakımı için de RAW 264.7 hücreleri genel sağlığı için hayati önem taşır. Pasaj 30 ya da daha yüksek bir ikinci hücreleri kullanılarak Buna ek olarak, plak deneyi daha yüksek bir başarısızlık oranı gözlemledik. Bu büyük olasılıkla laboratuvardan laboratuvara değişir rağmen, yüksek geçit RAW 264.7 hücreleri kullanarak, özellikle tekrarlanabilir titreleri sağlamak için (örneğin, bilinen bir viral titreye sahip bir örnek) bir pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Yüksek geçit hücrelerin kullanımını sınırlamak için, erken passa şişeleri dondurmak tavsiye edilirRAW 264.7 hücrelerin alınması ve sıklıkla dondurulmuş flakonlarından yeni bir kültür başlamak üzerine ge hücreleri. Hücreleri değişmiş gibi, hücre morfolojisi değişiklikler uymak (örneğin yuvarlak çırpı ve yaymak) başarısızlık gibi özellikler, veya mikoplazma kirlenme tespit edildiğinde sergilemek zaman düşük geçişi hücre kültürleri üzerinde başlayarak da yararlı olacaktır. Dikkat etmek önemli bir nokta da pipet uçları örnekleri arasında ve dilüsyonları sırasında değiştirilen sağlamaktır. Bu doğru seri dilüsyonları sağlamak ve örnekler arasında çapraz bulaşmayı önlemek olacaktır. Aynı örnek seri dilüsyonları kuyucuklara ilave edilmesi ile aynı pipet ucu tekrar kullanılabilir protokol içinde bir adımdır. Bu durumda, bir çok seyreltilmiş inokulum den az başlar ve yeni bir seyreltme çizerken şiddetle aşağı yukarı pipetle etmelidir.
Plak tahlil protokolü bazı modifikasyonlar iyileştirilebilir. T yapılabilir bir modifikasyonuburada iki kopya halinde kuyu inokülasyon için yeterli hücre olmayan her bir seyreltme için sadece tek bir iyi aşılamak için. Inokulum hacmi 0.5 ml olan Bununla beraber, plaklar sayı daha sonra pfu / ml 'ye normalleştirmek için 2 faktör ile çarpılır gerekmektedir. Plak tahlil da MNV replikasyon desteklemek mümkün olan herhangi bir diğer yapışık hücre hattı ile kullanım için adapte edilebilir, ve bu fare mikroglial BV-2 hücre dizisi 8 için tarif edilmiştir. Uygulanabilir diğer değişiklikler diğer virüsler için geliştirilen plak tahlil protokolleri için tarif edilmiştir uyarlamalar vardır. MNV halinde, aşağıdaki modifikasyonlar önceden başarılı bir şekilde uygulanmıştır; metil yerine Deniz Plak selüloz agaroz 9, ve kristal mor ya da yerine nötr kırmızı 10, 11 ve metilen mavisi ile boyanması hücrelerin kullanımı.
Diğer plak oluşturan virüs ölçmek için gerekli ya da oth için kullanılır Genel olarak, bu protokol kolayca adapte edilebilirgenel olarak bulaşıcı viral parçacıkların ölçmek için yararlı bir araç yapma, RAW 264.7 hücrelerinde litik enfeksiyonlara neden er virüsler.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz eleştirel görüş ve önerileriniz için Wobus laboratuar üyelerine teşekkür. CEW ve laboratuvarda çalışma Michigan Üniversitesi, Biyo-Savunma Mükemmeliyet NIH / NIAID Bölgesel Merkezi ve Gelişmekte Olan Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma (RCE) Programı, Bölge V 'Büyük bir kariyer geliştirme hibe start-up fonları tarafından finanse edildi Göller RCE (NIH ödülü 1-U54-AI-057153) ve NIH R01 AI080611. MBG-H. Michigan Üniversitesi Deneysel İmmünoloji (NIH T32 A1007413-16) ve Mikrobiyal Patogenezinde Moleküler Mekanizmalar (NIH T32 A1007528) eğitim hibeleri tarafından finanse edildi. JBC Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel Superior (Pelerin), Brasilia, Brezilya tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
| 2x MEM | Gibco | 11935 |
| 100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
| 10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
| 200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
| Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
| Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
| 1x PBS | Gibco | 10010 |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
| Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
| Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
| Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |
References
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis. Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).
- Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. Ch. 2. Fields Virology. 1, 25-58 (2007).
- Thackray, L. B. Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence. Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method for estimating 50% endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).
- Chachu, K. A. Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection. Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).
- Barron, E. L. Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute. PLoS ONE. 6, e21435 (2011).
- Cox, C., Cao, S., Lu, Y. Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line. Virology journal. 6, 196 (2009).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Hyde, J. L. Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway. Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).
- Simmonds, P. Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses. Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).
