Saggio di placca per Norovirus Murine

Summary

Qui si descrive un metodo per quantificare particelle infettive di norovirus murino (MNV), che è l'unica norovirus che replica efficiente in coltura cellulare. Il saggio di placca sfrutta MNV tropismo per i macrofagi murini e può essere adattato all'uso con campioni biologici o ambientali contenenti MNV.

Abstract

Norovirus murino (MNV) è l'unico membro del genere Norovirus che cresce in modo efficiente nella coltura del tessuto ^{1, 2.} Lisi cellulare e l'effetto citopatico (CPE) sono osservate durante MNV-1 infezione di cellule dendritiche murine o macrofagi ^1. Questa proprietà di MNV-1 può essere utilizzato per quantificare il numero di particelle infettive in un dato campione eseguendo un saggio di placca ^1. Il saggio di placca si basa sulla capacità di MNV-1 per lisare le cellule e per formare i fori in un monostrato di cellule confluenti, che sono chiamati placche ^3.

Molteplici tecniche possono essere utilizzate per rilevare infezioni virali in coltura tissutale, tessuto raccolto, clinica, e campioni ambientali, ma non tutti misura del numero di particelle infettive (es qRT-PCR). Un modo per quantificare particelle virali infettive è quello di eseguire un saggio di placca ^3, che sarà descritto in dettaglio nel seguito. Una variazione del saggio di placca MNV è la fluorfuoco saggio escent, dove è immunostained antigene MNV in monostrati cellulari ^4. Questo test può essere più veloce, in quanto espressione di antigene virale precede la formazione della placca. E 'anche utile per titolazione virus incapaci di formare placche. Tuttavia, il saggio fuoco fluorescente richiede risorse aggiuntive rispetto a quelle del saggio di placca, come anticorpi e un microscopio per contare fuoco unità formanti. MNV infettiva può anche essere quantificato determinando il 50% della dose infettante Tissue (TCID ₅₀₎ ^3. Questo saggio misura la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate coltura mediante titolazione finale ^5. Tuttavia, il suo limite di rilevamento è più alto rispetto ad un saggio di placca ^4.

In questo articolo, si descrive un protocollo di saggio di placca che può essere utilizzato per determinare efficacemente il numero di particelle infettive MNV presenti in campioni biologici o ambientali ^{1, 4, 6.} Questo metodo è based sulla preparazione di diluizioni seriali di 10 volte di MNV contenenti campioni, che vengono utilizzati per inoculare un monostrato di cellule permissive (RAW 264,7 macrofagi murini). Virus è consentito collegarsi al monostrato cellulare per un dato periodo di tempo e quindi aspirata prima di coprire cellule con una miscela di agarosio e mezzo di coltura. L'agar permette la diffusione della progenie virale alle cellule vicine, limitando la diffusione di cellule situate lontano. Di conseguenza, le cellule infettate vengono lisate e fori formano nel monostrato noto come placche. Alla diffusione del virus sufficiente, placche diventano visibili seguente colorazione delle cellule con coloranti, come il rosso neutro, blu di metilene, o viola cristallo. A basse diluizioni, ogni placca proviene da una particella infettiva virale e la sua progenie, che si è diffusa a cellule vicine. Così, contando il numero di placche permette di calcolare unità formanti placca (PFU) presenti nel campione non diluito ^3.

Protocol

1. Coltura della linea cellulare di macrofago RAW 264,7 Mantenere cellule RAW 264,7 (ATCC, catalogo # TIB-71) in DMEM-10 media, che consiste di glucosio DMEM alto con 10% (v / v) a bassa endotossina siero fetale bovino (<10 eu > Nota: è consigliabile avere diverse bottiglie con autoclavato SeaPlaque agarosio preparato in anticipo. Agarosio può essere rifuso in un forno a microonde prima dell'uso. Calcolare la quantità di sovrapposizione necessaria per il volume totale di piastre prima incubazione 1 ora è completa. Il volume necessario è di 2 ml / pozzetto o 12 piastra ml/6-well. Preparare agarosio (vedi paragrafo 3.2) e dei media (vedi sezione 3.3) a parte. Per preparare l'agarosio, 3 g di sospendere SeaPlaque agarosio in un volume totale di 100 ml di acqua distillata (3% w / v) in una bottiglia di vetro. Autoclave per 20-30 min. (Se agarosio è stato già preparato prima mano, re-melt agarosio in microonde.) È importante equilibrare SeaPlaque agarosio a 42 ° C in un bagno di acqua prima dell'uso perché se l'agarosio è troppo caldo, ucciderà le cellule. Assicurarsi che il livello dell'acqua è uguale o superiore al livello di agarosio per evitare la solidificazione indesiderato. Preparare il dispositivo: fare 100 ml di MEM 2x supporti, che consiste2x MEM, 10% (v / v) a bassa endotossina siero bovino fetale (<10 eu >

Discussion

Il metodo di analisi per la targa MNV-1 qui presentato è un modo di quantificare particelle infettive MNV. Seguendo la procedura del saggio illustrato in figura 3, si possono ottenere i titoli virali riproducibili. Il limite di rilevazione del test dipende dalla diluizione di partenza utilizzato. Quando si inizia con una diluizione 1:10 del campione come descritto sopra, il limite di rilevazione del saggio di placca è 10 pfu (cioè, 1 placca visibile a ^-1 10 diluizione). Poiché ogni placca rappresenta un singolo virus, il saggio di placca può anche essere usato per purificare popolazioni clonali di MNV sollevando placche isolate e moltiplicazione come descritto in precedenza ^1. Inoltre, purificazioni placca può anche essere utilizzato per separare una singola popolazione virus da popolazioni miste virus. Una limitazione di utilizzo di un saggio di placca per la rivelazione di infezione MNV è che non tutti i ceppi MNV formare placche ^4. Tuttavia, può essere possibile superare la inabilità di alcuni ceppi MNV, isolati da animali, per formare placche in modo seriale passaging questi virus in coltura ^7. In alternativa al saggio di placca è misurare particelle infettive tramite TCID ₅₀ tecnica ^{3, 4.} Questo test quantifica la quantità di virus necessaria per produrre CPE nel 50% delle cellule del tessuto inoculate colture seguenti diluizioni endpoint e prende 1 settimana a completare per MNV ^4. Oltre ad essere più lenta di un saggio di placca, la TCID ₅₀ saggio è così sensibile (limite di rilevazione = 200 TCID ₅₀ / ml) a causa della tossicità dei campioni di tessuto di cellule RAW 264,7 ^4.

Anche se i passaggi critici nell'ambito del protocollo sono stati descritti in tutto il protocollo, la sezione seguente fornisce una sintesi per facilitare la risoluzione dei problemi. La fase più critica del protocollo è quello di garantire che RAW 264,7 cellule rimangono vitali durante tutta la seduta di sostenere la replicazione del virus. Questo puòessere monitorato in ogni fase del test tramite microscopia ottica. La vitalità cellulare è assicurata in due modi. In primo luogo, si deve prestare attenzione a non far asciugare le cellule durante la manipolazione di lamiere. Così, le piastre vengono inoculati uno alla volta, scosso durante il periodo di infezione, e deve rimanere chiuso quando non sono stati trattati. In secondo luogo, le soluzioni aggiunto su cellule devono essere equilibrati a ~ 37 ° C. Inoltre, è essenziale per la salute generale delle cellule RAW 264,7 mantenerle in terreni contenenti siero partire endotossina (<10 EU / ml), che limita l'attivazione delle cellule. Inoltre, abbiamo osservato un tasso di fallimento superiore del saggio di placca usando cellule dal passaggio 30 o superiore. Anche se questo probabilmente variano da laboratorio a laboratorio, è importante includere un controllo positivo (ad esempio, un campione con un titolo virale noto) per garantire titoli riproducibili, soprattutto quando si utilizzano più elevati passaggio RAW 264,7 cellule. Per limitare l'uso di cellule di passaggio più elevati, si consiglia di congelare fiale del primo Passacellule ge dopo il ricevimento del RAW 264,7 cellule e iniziare una nuova cultura dai flaconi congelati frequentemente. Si riparte con colture cellulari a basso passaggio sarà anche utile quando le cellule presentano caratteristiche alterate, come ad esempio il mancato rispetto, i cambiamenti della morfologia cellulare (ad esempio, da rotondo a esile ed estesa), o quando la contaminazione da micoplasma è stato rilevato. Un altro punto importante da prestare attenzione è di garantire che i puntali delle pipette sono cambiati tra i campioni e durante le diluizioni. In questo modo garantire l'accuratezza dei diluizioni seriali e prevenire la contaminazione incrociata tra i campioni. Di un passo nel protocollo in cui il puntale stesso può essere utilizzato nuovamente quando diluizioni seriali dello stesso campione vengono aggiunti ai pozzetti. In tal caso, si deve partire da l'inoculo più diluito al minimo, e vigorosamente pipettare su e giù al momento di elaborare una nuova diluizione.

Il protocollo del saggio placca è modificabile di numerose modifiche. Una modifica che possono essere effettuate quando tqui non sono cellule sufficienti per vaccinare i pozzi in duplice copia è di inoculare solo un singolo pozzo per ogni diluizione. Tuttavia, poiché il volume dell'inoculo è 0,5 ml, il numero di placche deve poi essere moltiplicato per un fattore di 2 per normalizzare a pfu / ml. Il saggio di placca può anche essere adattato per l'uso con qualsiasi altra linea cellulare aderente che è in grado di supportare la replica di MNV, e questo è stato descritto per la linea murina microglia BV-2 cella ^8. Altre modifiche che possono essere attuate sono adattamenti che sono stati descritti per i protocolli di test placca sviluppati per altri virus. In caso di MNV, le seguenti modifiche sono già state realizzate con successo, l'uso di metil cellulosa invece di placca Mare agarosio ^9, e la colorazione delle cellule con violetto cristallo o blu di metilene al posto del rosso neutro ^{10, 11.}

Nel complesso, questo protocollo può essere facilmente adattato per quantificare altri formanti placca virus o utilizzati per OTHer virus che causano infezioni litiche in RAW 264,7 cellule, che lo rende uno strumento utile per quantificare particelle virali infettive in generale.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC